Chromatografii powinowactwa

Chromatografii powinowactwa jest chromatograficzny sposób rozdzielania w celu wyizolowania analitu z roztworu różnych substancji. Warunkiem wstępnym jest dostępność odpowiedniego liganda (partnera wiązania) dla interesującego analitu (białka). Jest to jedna z najpotężniejszych metod separacji . Jednak stosowane kolumny są stosunkowo drogie, więc metoda jest stosowana tylko w szczególnych przypadkach lub na małą skalę (skala laboratoryjna).

zasada

Chromatografia kolumnowa
Chromatografia okresowa

Separacja zwykle odbywa się w kolumnach, ale można ją również przeprowadzić w procesie okresowym . Działanie czyszczące tej metody opiera się albo na specyficznym rozpoznawaniu białka przez przeciwciało, albo, w przypadku enzymów, na zastosowaniu specyficznego powinowactwa enzymu do inhibitora , substratu lub kofaktora .

Faza stacjonarna , często żel , np. B. z dekstranów lub usieciowanej agarozy (nazwa handlowa Sepharose ), jest sprzężona z odpowiednim ligandem ( przeciwciało z. B. ), który specyficznie wiąże analit, który ma być oczyszczony. W praktyce należy uważać, aby powinowactwo do analitu nie było zbyt duże, ponieważ utrudnia to elucję. Odwrotnie, faza stacjonarna z białkiem (zwykle białkiem A , G lub L), które wiąże określone klasy immunoglobulin, może być również stosowana do preparatywnego oczyszczania przeciwciał (immunoglobulin) .

Aby związać ligand z materiałem nośnika, przekształca się go wcześniej w aktywowaną formę. Na przykładzie agarozy rozważana jest metoda aktywacji bromkiem cyjanu , w której generowane są reaktywne grupy imidowęglanowe, które reagują z grupami aminowymi analitu, tworząc wiązanie kowalencyjne. Po utrwaleniu ligandu o niskiej masie cząsteczkowej na matrycy (np. Aktywowanej agarozie), mogą wystąpić zawady przestrzenne, jeśli analit ma cząsteczki o dużej wielkości. W tym przypadku ligand może być sprzężony z matrycą poprzez element pośredni (łącznik). Jako rozpórki zwykle stosuje się krótkie łańcuchy węglowodorowe, które następnie do pewnego stopnia wystają z powierzchni matrycy.

Stała asocjacji, która pochodzi ze stałej równowagi , jest ważna dla wiązania liganda i białka docelowego . Im jest on większy, tym korzystniejszy jest rozdział chromatograficzny powinowactwa. Wartość powinna wynosić co najmniej K Ass  = 10 4  mol −1 .

podanie

Chromatografia powinowactwa jest stosowana przede wszystkim do oczyszczania i zatężania substancji z mieszaniny w roztworze buforowym lub do zmniejszania ilości substancji w mieszaninie. Chromatografia powinowactwa jest również często stosowana do określenia, które związki biologiczne wiążą się z określoną substancją lub do oczyszczenia i zatężenia roztworu enzymu.

wykonanie

Aby przeprowadzić prace chromatograficzne powinowactwa, obecnie najczęściej stosuje się biokompatybilne systemy HPLC , ale tutaj są one obsługiwane tylko przy niższych ciśnieniach do 150 barów. Tak zwane systemy FPLC (do angielskiej szybkiej chromatografii cieczowej białek ) działają nawet przy znacznie niższych ciśnieniach, często poniżej 10 barów. Rozdzielaną mieszaninę zwykle nakłada się na kolumnę za pomocą pętli próbek lub pomp do próbek, a interesująca substancja jest wiązana przez ligandy. Wszystkie inne substancje szybko opuszczają kolumnę, ponieważ nie oddziałują silnie z ligandem. Po etapie przemywania w celu usunięcia niespecyficznie związanych zanieczyszczeń, analit związany z ligandem jest również zmuszany do opuszczenia kolumny ( elucja ) poprzez zmianę warunków ( skład buforu ). Jako eluent często stosuje się kwaśny bufor lub mieszaninę rozpuszczalnik / woda. Alternatywnie można również dodać substancje, które działają konkurencyjnie z docelowym białkiem lub nadmiar wolnych ligandów. Eluat zawierający oczyszczony i wzbogacony analitu. Proces okresowy jest bardzo podobny do procedury opisanej powyżej dla działania kolumny. Ważną różnicą jest jednak zastosowanie wirowania i innych metod separacji, które są niezależne od ciśnienia. W zależności od wymagań oba procesy można również łączyć ze sobą, przy czym praca kolumny następuje po procesie okresowym.

Nowsze osiągnięcia opierają się na zastosowaniu kilku kolumn połączonych szeregowo. Tutaj drogie ligandy mogą być używane do maksymalnej liczby osób. Nie jest to możliwe w procesach jednokolumnowych, ponieważ część produktu nie jest już związana, a zatem byłaby eluowana i tracona. W procesach wielokolumnowych eluat jest zbierany w innej kolumnie. Poprzez naprzemienne ładowanie i eluowanie kolumn uzyskuje się okresowy proces, który jest często nazywany chromatografią ciągłą. Można to skutecznie wdrożyć za pomocą dwóch filarów; kolejne filary z kolei obniżają efektywność.

Procedury specjalne

Chromatografia powinowactwa ma szczególne zastosowanie w oczyszczaniu kwasów nukleinowych, białek lub krwi. Przykłady zawierają: His-Tag lub Strep -tag do oczyszczania rekombinowanych białek:

1. Powinowactwo immunologiczne: Oczyszczanie przeciwciał z surowic krwi
2. Chromatografia powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC): oparta na kowalencyjnym wiązaniu aminokwasów, zwłaszcza histydyny, z metalami
3. Rekombinowane białka
4. Lektyny : Białka, które wiążą węglowodany do oddzielnych substancji w próbce.

Przykłady

Przykłady ligandów do oczyszczania białek:

Ligand Docelowe białko
Antygen ,
białko A , białko G lub białko L. 		przeciwciało
Podłoże , kofaktor enzym
Ligand chwytnik
Lektyna Glikoproteina
kwasu nukleinowego Białko wiążące kwas nukleinowy
Streptawidyna , awidyna Biotyna ,
białko z peptydem streptawidyny
Chelat jonów metali,
taki jak Ni 2+ - NTA 		Białko z peptydem polihistydynowym

literatura

  • Heinz Bende: Chromatografia powinowactwa . W: Chemia w naszych czasach . taśma 8 , nie. 1 , 1974, s. 17-25 , doi : 10.1002 / ciuz.19740080104 .
  • Jerker Porath i in. (1975): Chromatografia powinowactwa do chelatów metali, nowe podejście do frakcjonowania białek. W: Nature. Vol. 258, nr 5536, str. 598-599. PMID 1678

Zobacz też

Indywidualne dowody

  1. ↑ Daniel Baur, Monica Angarita, Thomas Müller-Späth, Fabian Steinebach, Massimo Morbidelli: Porównanie okresowych i ciągłych procesów wychwytywania wielokolumnowego białka A według optymalnego projektu . W: Biotechnology Journal . taśma 11 , nie. 7 , 1 lipca 2016, s. 920-931 , doi : 10.1002 / biot.201500481 .
  2. ↑ Thomas GM Schmidt, Arne Skerra: System znaczników Strep do jednoetapowego oczyszczania i wykrywania wysokiego powinowactwa lub wychwytywania białek . W: Nature Protocols . taśma 2 , nie. 6 , s. 1528-1535 , doi : 10.1038 / nprot.2007.209 .
  3. ↑ Immobilized Lektyna. gelifesciences.com, GE Healthcare Lifesciences

linki internetowe