Transformacja (genetyka)

W biologii molekularnej transformacja polega na niewirusowym przenoszeniu wolnego DNA do kompetentnych komórek bakteryjnych, a także do grzybów, alg, drożdży i roślin. Pod transfekcją odnosi się do wstawienia DNA do eukariotycznych komórek zwierzęcych. Oprócz transdukcji i koniugacji, transformacja jest jedną z trzech opcji transferu genów u prokariontów .

fabuła

Naturalnie występujące zjawisko zostało po raz pierwszy wywołane i opisane eksperymentalnie przez Fredericka Griffitha w 1928 roku . W 1944 Oswaldowi Avery i jego kolegom udało się udowodnić, że jest to transfer kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA).

posługiwać się

Transformacja następuje jako etap podrzędny w klonowaniu . Podczas klonowania fragment DNA jest najpierw włączany do wektora . Ten zrekombinowany DNA jest następnie wprowadzany do bakterii poprzez transformację, która następnie rośnie iw tym procesie również mnoży wektor, a tym samym segment DNA. Pożądany segment DNA można w ten sposób bardzo często duplikować. Można go następnie wprowadzić do jądra obcej komórki poprzez horyzontalny transfer genów w celu wygenerowania transgenicznych zwierząt lub roślin .

Metody

Wolny DNA, zwykle plazmid , może być dodany do bakterii, które przy odpowiedniej obróbce mogą wchłonąć DNA. Tutaj wykorzystuje się naturalną kompetencję, aby skłonić komórki bakteryjne do wchłonięcia obcego DNA.

Jednak w przypadku niektórych bakterii, takich jak Escherichia coli , nie ma naturalnej kompetencji , dlatego do transformacji konieczne są etapy przygotowawcze.

Najprostszą metodą transformacji jest użycie komórek kompetentnych chemicznie. Komórki bakteryjne traktuje się chlorkiem wapnia lub, bardziej efektywnie, chlorkiem rubidu . DNA pobiera się przez inkubację przez 30 minut w 0-4 ° C; w przypadku niektórych szczepów E. coli krótkotrwały szok cieplny (41–43 ° C przez 45–90 sekund) zwiększa wydajność. Nie jest jasne, czy tworzy to pory w błonie, przez które DNA może dostać się do komórek, czy też inne mechanizmy powodują wychwyt. Traktowanie solą może przyczynić się do tego, że między ujemnie naładowanym DNA a ujemnie naładowaną błoną komórkową jest mniej sił odpychających. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda transformacji jest prosta i można ją przeprowadzić w krótkim czasie.

Inną metodą jest tzw. elektroporacja . Bakterie poddaje się wstrząsowi elektrycznemu (2000-2500 V przez kilka milisekund), aby przeprowadzić DNA przez błonę. Ta metoda jest znacznie skuteczniejsza niż metoda chemiczna. Jednak podłoże z bakteriami musi być całkowicie wolne od soli, w przeciwnym razie może wystąpić zwarcie . Powstała iskra zwarciowa nagle podgrzewa przemianę i zabija bakterie.

Mechanizmy

Niektóre bakterie mają zdolność pobierania wolnego DNA. Jest to determinowane przez różne białka kompetencyjne, które są coraz częściej syntetyzowane przez quorum sensing lub niedobór składników odżywczych. Ponieważ bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mają inną strukturę ściany komórkowej, należy je rozróżnić.

Bakterie Gram-dodatnie wiążą wolne DNA z białkiem kompetencyjnym. Przez endonukleazy DNA jest cięte co około 18 kpz i wprowadzane do komórki na nici. Druga, pozostała nić jest rozkładana przez nukleazy.

Bakterie Gram-ujemne mają kanał sekretynowy na błonie zewnętrznej i transporter DNA na błonie wewnętrznej do importu wolnego DNA . DNA jest najpierw importowane przez sekretynę. Wreszcie DNA jest importowane w jednej nici przez transporter, a druga nić jest rozbijana.

Po wchłonięciu jednoniciowego DNA wiąże się z dwuniciowym DNA komórki. Tworzy to potrójną helisę, w której białko RecA wymienia segmenty DNA. Prowadzi to do insercji i delecji w bakteryjnym DNA. Replikacja DNA tworzy teraz dwa różne pasma, ponieważ importowany rekombinacji DNA tylko jednej części.

Indywidualne dowody

  1. ↑ metoda chlorku wapnia (ang.)
  2. ↑ Pope, B. i HM Kent (1996). Wysoka wydajność 5 min transformacji Escherichia coli. Badania kwasów nukleinowych 24 (3): 536-537.
  3. ↑ Informacje o elektroporacji
  4. ↑ Porównanie różnych metod transformacji (PDF)
  5. ↑ M. Bakkali: Czy pobieranie DNA może być efektem ubocznym adhezji bakterii i ruchliwości drgającej? W: Archiwum mikrobiologii. Tom 195, Numer 4, kwiecień 2013, s. 279-289, doi : 10.1007 / s00203-013-0870-1 . PMID 23381940 . PMC 3597990 (darmowy pełny tekst).
  6. ^ JF Allemand, B. Maier, DE Smith: Silniki molekularne do translokacji DNA u prokariontów. W: Aktualna opinia w biotechnologii. Tom 23, numer 4, sierpień 2012, s. 503-509, doi : 10.1016 / j.copbio.2011.12.023 . PMID 22226958 . PMC 3381886 (darmowy pełny tekst).
  7. ^ ST Chancey, D. Zahner, DS Stephens: Nabyta indukowalna oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe u bakterii Gram-dodatnich. W: Mikrobiologia przyszłości. Tom 7, numer 8, sierpień 2012, s. 959-978, doi : 10.2217 / fmb.12.63 . PMID 22913355 . PMC 3464494 (darmowy pełny tekst).

literatura

Zobacz też