Technika patch clamp
Patch clamp ( angielski plaster techniki klamry ) to metoda pomiaru w elektrokardiogramie , w którym prąd płynący przez poszczególne kanały jonowe w błonie komórkowej z komórek będzie reprezentowane mierzone podczas Obecne poziomy kilku picoamperes (10 -12 Ah ). Technika ta została po raz pierwszy opisana w 1976 roku przez Erwina Nehera i Berta Sakmanna . Za swoją pracę nad funkcją poszczególnych komórkowych kanałów jonowych , którą wykonali tą techniką, otrzymali w 1991 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny . Technika patch-clamp zrewolucjonizowała badania elektrofizjologiczne dzięki możliwości obserwowania zachowania elektrycznego białek błonowych na poszczególnych cząsteczkach .
Termin plaster odnosi się do małego wycięcia w membranie ( łatka : łatka) pod pipetą, która służy również jako elektroda pomiarowa. Podczas pomiaru łatka membrany jest utrzymywana na z góry określonym potencjale ( do zaciśnięcia ). W zależności od tego, czy ten obszar błony jest usuwany z komórki po założeniu pipety łatkowej, czy też jest mierzony na nieuszkodzonej komórce, w technice patch clamp różnicuje się pewne konfiguracje.
Przegląd
Technologia patch-clamp opiera się na technologii cęgów napięciowych (angielski zacisk napięcia ; angielski to clamp : fasten, festklemmen; angielskie napięcie : napięcie), który był stosowany w latach trzydziestych XX wieku przez Kennetha Cole'a i HJ Curtisa do pomiaru prądów nienaruszone komórki nerwowe. W tym procesie do ogniwa wbijane są dwie elektrody: jedna służy do ustawiania napięcia podtrzymującego lub sterującego, podczas gdy druga elektroda służy do rejestrowania prądów występujących w poprzek membrany. Za pomocą tej technologii mierzy się sumę wszystkich pojedynczych prądów przepływających przez błonę komórkową; nie jest możliwe rozdzielenie poszczególnych składowych.
Wszystkie komórki zawierają w otaczającej je błonie komórkowej tak zwane kanały jonowe - białka, które mogą działać jak pory dla jonów rozpuszczonych soli . Kanały jonowe znajdują się również w błonach wewnątrz komórki, u roślin np. W tonoplastach - błonie, która oddziela centralną wakuolę od cytoplazmy . W żywych komórkach jony te występują w nierównomiernych stężeniach na zewnątrz i wewnątrz błony komórkowej; ta nierównomierna dystrybucja prowadzi do napięcia elektrycznego w poprzek membrany, potencjału transbłonowego . Kanały jonowe odgrywają ważną rolę zarówno w utrzymaniu spoczynkowego potencjału błony komórki, jak iw ewentualnych zmianach, które, gdy są nieregularne , nazywane są potencjałami czynnościowymi . Potencjały czynnościowe służą do przekazywania impulsów elektrycznych w organizmie (na przykład podczas wzbudzania ). Spoczynkowy potencjał błony zazwyczaj przyjmuje wartości około -70 mV dla komórek zwierzęcych i do -200 mV dla komórek roślinnych.
Ponieważ substancja nośnikowa biomembran , podwójna warstwa lipidowa , jest praktycznie nieprzepuszczalna dla wody i rozpuszczonych jonów, wcześnie założono, że zmianę przewodnictwa można osiągnąć jedynie poprzez otwarcie lub zamknięcie określonych białek błonowych, kanałów jonowych. Dwóch brytyjskich naukowców Alan Hodgkin i Andrew Huxley opracowali model, który przewidywał istnienie w błonie komórkowej bramek zależnych od napięcia , które całkowicie otwierają się lub zamykają zgodnie z zasadą „wszystko albo nic” . W 1969 roku po raz pierwszy można było zademonstrować tę funkcję bramki bakteryjnego białka błonowego gramicydyny A.
Jednak przy pomocy pomiarów cęgów napięcia nie było możliwe zbadanie mechanizmów molekularnych tych bramek , kanałów jonowych. Technika patch-clamp została znacznie ulepszona. Tutaj elektroda nie jest już wstawiana do komórki, ale jest umieszczana bezpośrednio na błonie komórkowej. Bardzo mały otwór pipety (ok. 1 µm ) umożliwia wykrycie pojedynczego białka kanału jonowego z dużym prawdopodobieństwem. Jednocześnie pomiędzy szklaną krawędzią elektrody pomiarowej a membraną celki zostaje utworzone elektrycznie szczelne połączenie, dzięki czemu można pominąć występujące prądy upływowe . W ten sposób można mierzyć bardzo małe prądy (rzędu 5 pA). Elektroda służy do ustawiania napięcia podtrzymującego lub sterującego, a także do pomiaru prądów jonów. To podwójne zadanie jest możliwe dzięki zastosowaniu wzmacniacza operacyjnego podłączonego do wirtualnej masy w elektronice pomiarowej; można pominąć drugą elektrodę ze stykiem ogniwa.
Ogólnie rzecz biorąc, technologia patch-clamp stawia wysokie wymagania zastosowanym urządzeniom i elektronice pomiarowej (niski poziom szumów, długoterminowa stabilność), jednocześnie wymaga od eksperymentatora bardzo umiejętności posługiwania się urządzeniem i materiałem biologicznym.
Urządzenia i materiały
Stacja pomiarowa
Do pracy z technologią patch clamp zwykle konfiguruje się stanowisko pomiarowe , które jest zwykle wyposażone w różne urządzenia. Klatka Faradaya do ekranowania elektrycznego stoi na stole pomiarowym z tłumieniem drgań . Wewnątrz znajduje się odwrócony mikroskop z mikromanipulatorem do pozycjonowania pipety łatkowej. Uchwyt pipety podłączany jest do przedwzmacniacza , uchwyt próbki do elektrody do kąpieli. Sygnał z przedwzmacniacza wzmacniany jest we wzmacniaczu patch clamp. Monitor służy do obserwacji mierzonego obiektu i pipety skrawającej przez kamerę mikroskopu. W większości przypadków komputer i urządzenie do przechowywania danych znajduje się bezpośrednio na stanowisku pomiarowym do rejestracji cyfrowej w celu oceny i rejestracji sygnałów elektrycznych . Zachowanie komórki można również zarejestrować za pomocą magnetowidu .
Elektroda pomiarowa (pipeta łatkowa)
Elektroda pomiarowa wykonana jest ze szklanej kapilary, która jest bardzo cienko wyciągnięta pod wpływem ciepła. Jako materiał szklany zwykle stosuje się szkło borokrzemianowe ; wyciąganie może być zautomatyzowane za pomocą odpowiednich urządzeń ( ściągacz ); Można ustawić takie parametry, jak temperatura i napięcie nagrzewania. Często końcówka pipety jest polerowana termicznie po pociągnięciu , tworząc możliwie gładkie krawędzie na końcówce, co sprzyja tworzeniu szczelnego elektrycznie połączenia ( gigaseal ) między pipetą a membraną.
Pipeta staje się elektrodą poprzez wypełnienie jej roztworem przewodzącym , w którym zanurzony jest srebrny drut pokryty chlorkiem srebra . Wypełniona pipeta łatkowa jest zaciskana w uchwycie i podłączana do znajdującego się tam przedwzmacniacza wraz z kolejną elektrodą z drutu srebrnego znajdującą się w kąpieli. Niewielka odległość między elektrodą pomiarową a wzmacniaczem jest niezbędna, aby zredukować do minimum nakładanie się bardzo małych prądów pomiarowych wywołanych przez zewnętrzne sygnały zakłócające. Rezystancja elektrody pomiarowej wypełnionej roztworem wynosi zwykle od 1 do 5 MΩ . Dodatkowa powłoka pipety łatkowej elastomerami silikonowymi ogranicza hałas układu pomiarowego i zapobiega zwiększaniu się jego pojemności elektrycznej na skutek zwilżania roztworem kąpieli. Końcówka pozostaje wolna do około 50 µm.
Gigaseal tworzy się zwykle tylko wtedy, gdy do pomiaru używa się świeżo (kilka godzin) wyprodukowanych pipet łatkowych.
Przygotuj komórki
Rzadko kiedy zewnętrzna błona komórkowa komórek jest w pełni dostępna; do pomiaru patch clamp, komórki często muszą być najpierw przygotowane.
Komórki zwierzęce
Komórki zwierzęce można oddzielić enzymatycznie od blaszki podstawnej i uwolnić od pozostałości tkanki łącznej . Ten krok można czasami pominąć w przypadku komórek, które wyrosły w hodowli komórkowej .
Komórki roślinne
Komórki roślinne są otoczone ścianą komórkową , która jest zwykle usuwana w wyniku enzymatycznego trawienia celulazami i hemicelulazami . Gdy tylko składniki ściany komórkowej zostaną dostatecznie zniszczone, komórki można usunąć z pozostałych pozostałości, po prostu delikatnie nimi wstrząsając lub przenosząc je do roztworu hipoosmotycznego. Takie protoplasty (komórki bez ściany komórkowej) często rozpoczynają się ponownie od tworzenia nowego materiału ściany komórkowej bezpośrednio po ich wyjęciu z kąpieli enzymatycznej, dlatego pomiar należy wykonać jak najszybciej po protoplastacji .
Wykonanie pomiaru
Wypełnioną pipetę łatkową zaciska się w mikromanipulatorze, podłącza do wzmacniacza patch clamp, a następnie ostrożnie dociska do nienaruszonej komórki pod kontrolą optyczną (obserwacja w mikroskopie lub na podłączonym do niej monitorze) . Poniżej pipety, w obrębie średnicy końcówki znajduje się kawałek membrany - łatka lub łatka membrany . Następnie tworzy się mocne połączenie (uszczelnienie) pomiędzy membraną a pipetą poprzez przyłożenie niewielkiego podciśnienia do tylnego końca pipety. Tworzy to opór elektryczny rzędu kilku gigaomów (10 9 omów) między wnętrzem pipety a roztworem zewnętrznym , tak zwany „gigaseal” ( do uszczelniania ). Wraz z produkcją Gigaseal, osiągnięto tak zwaną konfigurację z przyłączem komórkowym technologii patch-clamp ( do mocowania, do mocowania, do mocowania). Ze względu na duży opór Gigaseal, prąd przepływający przez kanał jonowy w obrębie plastra musi również przepływać przez zawartość pipety. W roztworze pipety zanurza się elektrodę podłączoną do czułego wzmacniacza. Umożliwia to pomiar aktywności pojedynczego kanału jonowego w błonie plastra. Zarówno błona komórkowa, której składnikiem jest łatka, jak i wnętrze komórki pozostają nienaruszone w tej konfiguracji.
Plaster można otworzyć przez dalsze przykładanie podciśnienia na koniec pipety lub krótkie impulsy napięcia elektrycznego na elektrodzie w pipecie, podczas gdy Gigaseal pozostaje nienaruszony. Istnieje teraz ciągłość między wnętrzem pipety a wnętrzem kuwety, podczas gdy oba są odizolowane od roztworu zewnętrznego dzięki wysokiej rezystancji Gigaseal. Ta konfiguracja techniki patch clamp jest nazywana konfiguracją całych komórek (ang. Cała komórka - cała komórka). W tej konfiguracji pochodzi z całej błony komórkowej. Ponieważ roztwór pipety wypełnia wnętrze komórki, jego skład musi być podobny do cytozolu . Jednocześnie taka konfiguracja daje możliwość manipulacji kuwetą od wewnątrz za pomocą roztworu pipety.
Jeśli plaster nie zostanie otwarty po osiągnięciu konfiguracji przylegającej do komórki , ale pipeta zostanie delikatnie usunięta z komórki, część membrany znajdująca się pod końcówką pipety odłącza się od komórki i pozostaje na pipecie. Poprzednio wewnętrzna strona tego elementu membrany skierowana jest teraz na zewnątrz do roztworu kąpieli, podczas gdy wcześniej zewnętrzna strona elementu membrany znajduje się wewnątrz pipety. Jest to tak zwana konfiguracja wywrócona na zewnątrz . Podobnie jak w przypadku konfiguracji z komórkami , umożliwia pomiar poszczególnych kanałów jonowych w części membrany na końcówce pipety. W przeciwieństwie do tego, jednak w wewnątrz-out konfiguracji środowiska na wewnętrznej błonie można manipulować. Jeśli pipeta jest wypełniona roztworem symulującym środowisko zewnątrzkomórkowe, można zbadać zachowanie kanałów jonowych w zależności od składu cytozolu. Istnieje również możliwość zbadania pojedynczych kanałów jonowych przy użyciu konfiguracji z zewnątrz na zewnątrz . Plaster wybrzusza się z otworu pipety i zewnętrzna strona membrany znajduje się teraz w roztworze kąpieli. W tym przypadku środowisko przestrzeni pozakomórkowej może być modulowane przy zachowaniu środowiska cytozolowego.
Dzięki tej metodzie możliwe jest nawet zmierzenie funkcji komórek w ich naturalnym środowisku w żywym organizmie ( in vivo ).
Płaski zacisk krosowy
Planar patch clamp to nowa metoda, która została opracowana w celu zwiększenia wydajności w elektrofizjologii , między innymi w celu zaspokojenia rosnącej potrzeby pomiarów patch clamp w badaniach farmaceutycznych .
Zamiast umieszczać pipetę na adherentnej komórce , zawiesinę komórek pipetuje się na chip, w którym wykonano mikrostrukturalny otwór (aperturę).
Następnie pojedyncza kuweta jest zasysana do otworu z podciśnieniem i między ogniwem a szkłem zostaje utworzone połączenie szczelne elektrycznie (Gigaseal). Płaska geometria ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalną metodą patch clamp, takie jak: B. integracja kanałów mikroprzepływowych pozwala na automatyczne dodawanie składników aktywnych, zgodnie z wymogami badań farmaceutycznych . System jest dostępny dla procedur mikroskopii optycznej i skanującej . Perfuzji w wewnątrzkomórkowej stronie jest dużo łatwiejsze, co oznacza, że substancje czynne , które mają wpływ wewnątrzkomórkowego można lepiej zbadać. Do wykonywania pomiarów nie jest wymagane żadne specjalne szkolenie. Nieprzylegające komórki (takie jak krwinki czerwone ), które są klasycznie bardzo trudne do zbadania, są znacznie łatwiejsze do naklejenia w sposób płaski. Układy pomiarowe można zminiaturyzować. Podczas gdy klasyczna konfiguracja może z łatwością wypełnić połowę przestrzeni laboratoryjnej, konfiguracja planarna może być również wdrożona jako urządzenie stołowe.
Zalety są równoważone przez pewne wady, takie jak: B. adhezja komórek, takich jak neurony lub makrofagi, do powierzchni, na której były hodowane. W przypadku oderwania enzymatycznego należy upewnić się, że proteazy nie wpływają na białka kanałowe na powierzchni komórki. Komórki adherentne nie mogą być łatane w ściśle fizjologicznych warunkach. Dlatego też systemy płatków planarnych są najbardziej rozpowszechnione w hodowlach komórek transfekowanych . Ponieważ komórki muszą być rozdzielone, pomiary na skrawkach tkanek nie są możliwe. Należy upewnić się, że zawiesina komórek jest jednorodna, ponieważ łatana komórka jest wybierana „na ślepo” z zestawu. Komórki nie można wybrać na podstawie jej kształtu ani etykiety fluorescencyjnej . Pomimo rozległej miniaturyzacji, koszty zakupu na kanał pomiarowy są w podobnym zakresie jak w przypadku konwencjonalnego patch clampa. Dlatego systemy wysoce równoległe są opłacalne tylko przy odpowiednio dużej liczbie przejazdów.
Zobacz też
literatura
- E. Neher, B. Sakmann: Badanie sygnałów komórkowych techniką patch-clamp. Spectrum of Science, maj 1992, s. 48–56 .
- Erwin Neher: Kanały jonowe do komunikacji między komórkami i wewnątrz komórek. Wykład z nagrodą Nobla grudzień 1991 (angielski, PDF)
- B. Sakmann, E. Neher: Nagrywanie jednokanałowe . Springer, 1995, ISBN 1-4615-7858-2 .
- M. Numberger, A. Draguhn: Technika zaciskania łat . Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1996, ISBN 3-8274-0023-6 .
- B. Hille: Kanały jonowe w błonach pobudliwych. , Wydanie trzecie, Sunderland 2001, ISBN 0-87893-321-2 .
linki internetowe
- DC Ogden: techniki mikroelektrod, podręcznik warsztatów The Plymouth . 2. edycja. Company of Biologists, Cambridge 1994, ISBN 0-948601-49-3 . (Angielski, PDF).
Indywidualne dowody
- ↑ E. Neher, B. Sakmann. Prądy jednokanałowe rejestrowane z błony odnerwionych włókien mięśniowych żaby. W: Nature . 260, 1976, str. 799-801.
- ↑ Informacja z tej Fundacji Nobla na ceremonii 1991 nagród do Erwin Neher i Bert Sakmann (English)
- ↑ OP Hamill, E. Neher, B. Sakmann, FJ Sigworth: Ulepszone techniki patch-clamp do zapisów prądu o wysokiej rozdzielczości z komórek i plastrów błony bezkomórkowej. W: Pflügers Arch . 391, 1981, str. 85-100.
- ↑ KS Cole: głównie błony . W: Annu Rev Physiol . 41, 1979, str. 1-24.
- ↑ RC Bean, WC Shepherd, H. Chan, JT Eichler: Dyskretne fluktuacje przewodnictwa w błonach białek dwuwarstwowych lipidów. W: J. Gen. Physiol. 53, 1969, str. 741-757, doi : 10.1085 / jgp.53.6.741 .
- ↑ SB Hladky, DA Haydon: Dyskrecja zmiany przewodnictwa w bimolekularnych błonach lipidowych w obecności niektórych antybiotyków . W: Nature. 225, 1970, str. 451-453, doi : 10.1038 / 225451a0 .
- ↑ Sake Vogelzang: Stan polaryzacji błony plazmatycznej w komórkach roślinnych. Proefschrift, Rijksuniversiteit Groningen, 1996.
- ^ Christian Schmidt, Michael Mayer, Horst Vogel: Biosensor oparty na chipie do analizy funkcjonalnej pojedynczych kanałów jonowych 13 . W: Angewandte Chemie . taśma 112 , nie. 17 , 2000, s. 3267-3270 , doi : 10.1002 / 1521-3757 (20000901) 112: 17 <3267 :: AID-ANGE3267> 3.0.CO; 2-1 .
- ↑ Jan C. Behrends, Niels gotowy: Planar Patch Clamping. W: Neuromethods. Vol. 38, str. 411–433 ( PDF ).
- ↑ Małe dziury, duży wpływ - fizjologia komórki w formacie chipa . Lista nominowanych do German Future Prize 2007, dostęp 18 kwietnia 2010.
- ↑ Pomiary kanałów jonowych przy dużej przepustowości - od laboratorium uniwersyteckiego do globalnego gracza . Lista nominowanych do German Future Prize 2014, dostęp 6 marca 2015.