Kryształ białka
Kryształy białka są badane w krystalografii białek ; składają się z oczyszczonego białka i dużych ilości wody krystalicznej . W krysztale białkowym, jak w każdym krysztale wykonanym ze związków organicznych lub nieorganicznych, identyczne cząsteczki lub kompleksy molekularne są ułożone dokładnie w ten sam sposób w punktach sieci krystalicznej. Bazie kryształu składa się następnie aż do kilku tysięcy węgla. Określenie struktury białek dostarcza nie tylko cennych informacji do badań podstawowych, ale także w coraz większym stopniu wspiera rozwój leków w przemyśle farmaceutycznym.
fabuła
O ile strukturę kryształów z prostych związków chemicznych można było stosunkowo szybko wyjaśnić jeszcze młodą metodą rentgenowskiej analizy struktury ( chlorek sodu 1913, benzen 1928), o tyle z białkami, które składają się z tysięcy atomów, powstały duże trudności eksperymentalne. Pierwszą trudnością była izolacja, oczyszczanie i krystalizacja białek. Jamesowi Batchellerowi Sumnerowi udało się to zrobić po raz pierwszy w 1926 r. Za pomocą enzymu ureazy i białek konkanawaliny A i B z fasoli . Zastosowanie krystalizacji białek jako metody ogólnej zasugerował John Howard Northrop np. B. za pomocą pokazu pepsyny z 1929 roku. Obaj badacze otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1946 roku za te osiągnięcia .
Dopiero na początku lat trzydziestych brytyjski fizyk, krystalograf i historyk nauki John Desmond Bernal i jego koleżanka Dorothy Crowfoot Hodgkin (która otrzymała samą nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1964 r.) Odnieśli sukces w uzyskaniu ostrych obrazów dyfrakcyjnych kryształów białek. Aby jednak określić trójwymiarową strukturę białek na podstawie tych obrazów dyfrakcyjnych , potrzebny był ogromny wysiłek obliczeniowy, który stał się łatwiejszy do wykonania wraz z rozwojem komputera . Pierwszą strukturę białka ( mioglobiny ) wyjaśnił John Cowdery Kendrew za pomocą krystalografii rentgenowskiej w 1958 roku (Nagroda Nobla w dziedzinie chemii 1962, wraz z Maxem Perutzem , który zdecydowanie opracował tę metodę). Wraz z pojawieniem się metod inżynierii genetycznej do produkcji rekombinowanych białek w latach osiemdziesiątych XX wieku, odbudowę ułatwiły białka. Wcześniej oczyszczanie i charakterystyka pojedynczego białka stanowiły zakres biochemicznej rozprawy doktorskiej, a metody inżynierii genetycznej pozwoliły na produkcję i oczyszczanie wielu białek w znacznie zwiększonych ilościach, co zmniejszyło nakład pracy potrzebny do oczyszczenia. Kolejnym kamieniem milowym było wyjaśnienie struktury pierwszego białka błonowego ( centrum reakcji fotosyntezy ) przez Johanna Deisenhofera , Roberta Hubera i Hartmuta Michela , którzy zostali uhonorowani nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 1988 roku. Dziesiątki tysięcy białek i kompleksów białkowych - w tym duże cząstki, takie jak rybosomy (po raz pierwszy autorstwa Ada Yonath ) i wirusy - zostały skrystalizowane i scharakteryzowane strukturalnie (patrz łącze internetowe RCSB-PDB ).
cechy
Kryształy białka bardzo rzadko pojawiają się w cytoplazmie . Istotną różnicą między kryształami drobnocząsteczkowymi i kryształami makrocząsteczkowymi jest bardzo duża ilość rozpuszczalnika w tym ostatnim. Kryształu wody kryształów białka zajmuje około 30-80% ilości kryształów, a częściowo w postaci quasi-płynem w zagłębieniach między cząsteczkami białka . Tylko ułamek powierzchni białka jest zaangażowany w kontakty kryształów, reszta jest całkowicie solwatowana, w wyniku czego kryształy białek są bardzo miękkie i kruche w porównaniu z kryształami jonowymi lub molekularnymi . W przeciwieństwie do kryształów jonowych lub molekularnych, kryształy białek są bardzo wrażliwe na utratę wody. Jednak ze względu na dużą zawartość wody możliwe jest również umożliwienie dyfuzji ligandów, kofaktorów i substratów o małej masie cząsteczkowej z otaczającego ługu macierzystego do kanałów rozpuszczalnika w krysztale.
Duże puste przestrzenie między cząsteczkami białka można zilustrować faktem, że np. B. bezbarwny kryształ lizozymu jest w sposób ciągły zabarwiony na niebiesko przez dodanie błękitu metylenowego , ale barwnik jest ponownie powoli uwalniany przez dyfuzję po przeniesieniu do ośrodka bezbarwnego (analogicznie do zeolitów ). Ta właściwość kryształów białkowych również w wyjaśnienia struktury białka przez strukturę krystaliczną analizy za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej , w których pochodne ciężkiego atomu (np uran , rtęć, itp) jest wytwarzany przez umieszczenie kryształów w odpowiednich roztworach metali ciężkich w postaci soli. Ze względu na chiralny charakter naturalnie występujących białek, krystalizują one tylko w 65 chiralnych z 230 możliwych krystalograficznych grup przestrzennych , które nie mają lustrzanych płaszczyzn ani centrów inwersji.
Produkcja
W celu uzyskania wystarczającej ilości białka, białka są obecnie często najpierw poddawane nadekspresji w E. coli lub drożdżach , ponieważ oczyszczanie białek jest znacznie łatwiejsze i można również bardzo łatwo otrzymać duże ilości białka. Coraz częściej białka ulegają krystalizacji w hodowlach komórek owadzich i ludzkich komórkach HEK . Prawidłowe sfałdowanie niektórych białkach jest możliwa tylko przez modyfikacje potranslacyjne wyższych eukariontów , które mogą być istotne zwłaszcza do wytwarzania białek membranowych .
Podstawowym wymaganiem do produkcji kryształów białka są wystarczające ilości wysoce czystego białka. Cząsteczki białka można oddzielić od innych białek za pomocą kombinacji metod strącania, chromatografii lub preparatywnej elektroforezy . Warunki krystalizacji określa się następnie łącząc wysoce stężone roztwory białek (ok. 2–20 mg białka / ml) z różnymi roztworami buforowymi , które zwykle zawierają bardzo duże stężenia soli (np. Siarczanu amonu), alkoholi (np. Etanolu i Metylopentanodiol) lub glikol polietylenowy (PEG), miesza się małymi kroplami o objętości w zakresie od nano do mikrolitrów i pozostawia w stałej temperaturze na dni, tygodnie i miesiące.
Aby zarazki mogły się rozwinąć, mieszanina środka wytrącającego białka musi znajdować się w obszarze zarodkowania , tj. H. na diagramie fazowym w obszarze przesyconym. Aby stopniowo zbliżać się do tego obszaru, można rozważyć następujące metody:
- Metoda zawieszania lub osadzania: kropla roztworu białka o niskim stężeniu środka strącającego znajduje się na górze lub z boku naczynia nad roztworem o wysokim stężeniu środka strącającego. Stopniowo następuje dyfuzja rozpuszczalnika (wody) w fazie gazowej , co prowadzi do przesycenia kropli.
- Dyfuzja na granicy faz : roztwór białka i roztwór środka strącającego stykają się ze sobą w kapilarze poprzez wspólną granicę faz. Środek strącający, o znacznie mniejszym rozmiarze cząstek, dyfunduje przez interfejs do roztworu białka.
W procesie okresowym roztwór musi już znajdować się w obszarze zarodkowania. Próbkę i mieszaninę strącającą miesza się razem, aby utworzyć kroplę pod izolacyjną warstwą oleju.
Do wyjaśnienia struktury kryształu potrzebne są monokryształy (odpowiadające im kryształy pokazano na zdjęciach 1 i 2) - znacznie częściej jednak powstaje amorficzny osad lub kryształy, które nie nadają się do takiego badania (fot.4 i 5). Gdy tylko rosną nawet małe kryształki białka, jest to wielki sukces, ponieważ można wtedy zoptymalizować warunki krystalizacji. Decydującymi parametrami rozpuszczalności są wartość pH, „wysalanie”, „wysalanie”, siła jonowa, rozpuszczalniki organiczne (stała dielektryczna) i temperatura. Parametry krystalizacji należy badać w różnych temperaturach np. 20 ° C i 4 ° C.
Nowa metoda pomiaru wykorzystująca lasery rentgenowskie o dużej intensywności, na przykład w European XFEL , pozwala na użycie najmniejszych kryształów pojedynczych białek, które są rozpylane na ścieżkę wiązki w strumieniu wody i generują indywidualne obrazy dyfrakcyjne.
Istnieją jednak również białka, których nie można skrystalizować, w tym większość dotychczasowych białek błonowych . Oprócz zwykłych środków wytrącających białka wymagają one zwykle również detergentów lub środków powierzchniowo czynnych , np. B. β-D-oktyloglukozyd, który ma rozpuszczalną w wodzie część cząsteczki i część hydrofobową. Ten ostatni wiąże hydrofobowy (rozpuszczalny w tłuszczach) region transbłonowy, który składa się głównie z α-helis. Większa liczba cząsteczek środka powierzchniowo czynnego może następnie wykorzystywać składniki hydrofilowe do utrzymywania białka błony w roztworze wodnym bez wystąpienia agregacji i nieuporządkowanego wytrącania. W związku z tym wspomniane już metody oczyszczania białek można zastosować przed przetestowaniem różnych warunków krystalizacji.
Czasami metody krystalizacji prowadzą również do tworzenia bardzo dziwnych kryształów, takich jak kryształ motyla (zdjęcie 5).
analiza
Przy pomocy dyfrakcji rentgenowskiej można badać zarówno monokryształy białek (patrz metoda Laue ), jak i krystaliczne proszki białek (patrz metoda Debye-Scherrera ).
Potencjalne monokryształy białek są zwykle zamrażane w ciekłym azocie przed badaniem na dyfraktometrze monokryształów, a następnie umieszczane w strumieniu gazu w temperaturze ok. -170 ° C w celu zmniejszenia uszkodzeń kryształu białka spowodowanych oddziaływaniem z promieniami rentgenowskimi . Rozpraszanie kryształów nie oznacza jeszcze, że są one kryształami białek, ponieważ sole często krystalizują z roztworów buforowych . Jednak można je odróżnić od kryształów białek poprzez badanie przy użyciu dyfraktometru rentgenowskiego, ponieważ oba dają bardzo typowe, różne obrazy rozproszone.
Do badania metodą dyfrakcji rentgenowskiej (w zależności od zastosowanej metody) wymagane są monokryształy wysokiej jakości i czystości, których wytwarzanie jest bardzo złożone. Dlatego w badaniach i przemyśle coraz częściej stosuje się wysokowydajne badania przesiewowe lub metody zautomatyzowane do oczyszczania dużej liczby białek i testowania warunków krystalizacji. Niektóre stacje pomiarowe ( linie wiązki ) w systemach synchrotronowych, które pracują z promieniowaniem rentgenowskim o wysokiej intensywności, są teraz wyposażone w roboty, które analizują dyfrakcję kryształów białek, wybierają odpowiednie próbki do wyjaśnienia strukturalnego i, jeśli to konieczne, mierzą kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych.
Ostatnio lasery rentgenowskie, takie jak European XFEL, pozwalają na wysokie tętno, tj. H. Błysk rentgenowski jest generowany co 220 nanosekund, co idealnie generuje obraz dyfrakcyjny mikrokryształu znajdującego się na drodze wiązki. Metoda opiera się na ciągłym pomiarze wielu tysięcy kryształów, których dyfrakcja ostatecznie dostarcza kompletnego zestawu danych czynników strukturalnych. Gdy tylko uzyskana zostanie odpowiednia informacja o fazie, można obliczyć gęstości elektronów, tak jak w przypadku bardziej konwencjonalnych metod analizy struktury rentgenowskiej, i można stworzyć trójwymiarowy model białka ze współrzędnymi atomowymi.
literatura
- Bernhard Rupp: Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology Garland Science, Taylor & Francis Group, Nowy Jork 2010, ISBN 978-0-8153-4081-2
linki internetowe
- PDBe Protein DataBank w Europie - baza danych swobodnie dostępnych współrzędnych atomowych biomolekuł w Europie
- PDBj Protein DataBank Japan - Baza danych swobodnie dostępnych współrzędnych atomowych biomolekuł w Japonii
- RCSB-PDB Research Collaboratory for Structural Bioinformatics - Baza danych swobodnie dostępnych współrzędnych atomowych biomolekuł w Ameryce
Indywidualne dowody
- ↑ a b c d e Wermuth, CG; Aldous, David; Raboisson, Pierre; Rognan, Didier: Praktyka chemii medycznej . Wydanie 4. Londyn, Wielka Brytania, ISBN 978-0-12-417213-5 .
- ↑ JC Kendrew, G. Bodo, HM Dintzis, RG Parrish, H. Wyckoff, DC Phillips: Trójwymiarowy model cząsteczki mioglobiny uzyskany za pomocą analizy rentgenowskiej . W: Nature . 181, nr 4610, marzec 1958, str. 662-666. doi : 10.1038 / 181662a0 . PMID 13517261 .
- ↑ Częstotliwości grup kosmicznych w zasobach PDB.
- ^ Nicolas Brener, Faiz Ben Amar, Philippe Bidaud: Projektowanie modułowych systemów kratowych z chiralnymi grupami przestrzennymi. (PDF; 4,0 MB) 31 października 2007.
- ^ A. Pandey, K. Shin, RE Patterson, XQ Liu, JK Rainey: Aktualne strategie produkcji i oczyszczania białek umożliwiające biologię strukturalną białek błonowych. W: Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire. Tom 94, numer 6, grudzień 2016, s. 507-527, doi : 10.1139 / bcb-2015-0143 , PMID 27010607 , PMC 5752365 (pełny tekst dowolny) (recenzja).
- ↑ L. Schuldt, J. Müller-Dieckmann, MS Weiss: Crystallization of biologicznych makrocząsteczek, PdN Chemie in der Schule nr 2/60 rok 2011, Aulis Verlag, s.11.
- ↑ a b Desy News on the European XFEL na stronie www.desy.de , dostęp 19 lipca 2020 r.
- ^ Krystalografia makromolekularna, część 3, Charles W. Carter, Jr., Academic Press, 2003, ISBN 0-08-049709-8 , s. 264 ( ograniczony podgląd w Google Book Search).