Mikroskopia ciemnego pola

Liść pod pod słabym oświetleniu pola
Krewetki aktywowanych wykonane w ciemnym polu

Mikroskopia ciemnego pola jest znany od ponad 250 lat wariant mikroskopie świetlnym . Prowadzi to do ciemnego tła, na którym wyraźnie wyróżniają się obserwowane struktury. W rezultacie można nadal generować dobrze rozdzielone obrazy o wysokim kontraście z przezroczystych obiektów o bardzo niskim kontraście , bez konieczności wcześniejszego kolorowania. Z łatwością można też obserwować żywe przedmioty. Do czasu rozwoju mikroskopii z kontrastem fazowym w latach 30. XX wieku mikroskopia ciemnego pola była jedyną metodą wzmocnienia kontrastu w próbkach niewybarwionych . W przeciwieństwie do mikroskopii ciemnego pola, technologia „normalnej” mikroskopii świetlnej nazywana jest mikroskopią jasnego pola .

Zasada mikroskopii ciemnego pola polega na tym, że przedmioty nie tylko pochłaniają światło , ale również zawsze odbijają część wiązki światła. Jeśli oświetlenie jest ustawione tak, aby bezpośrednie promienie światła przechodziły przez soczewkę mikroskopu, widz widzi tylko światło odbite. Jedną z przyczyn rozpraszania się światła jest rozpraszanie światła na małych cząsteczkach, znane jako efekt Tyndalla , który można zaobserwować również np., gdy światło wpada do ciemnego pomieszczenia, a kurz w wiązce światła jest wyraźnie widoczny. Cząstki, które są mniejsze niż limit rozdzielczości mikroskopu, również odbijają światło i dlatego można je wykryć za pomocą mikroskopu z ciemnym polem. W ten sposób można badać niektóre właściwości, takie jak ruchliwość cząstek. Ta aplikacja była ważniejsza niż ultramikroskopia na początku XX wieku .

Preparat można oświetlić od tyłu, patrząc od obiektywu (światło przechodzące) lub od strony obiektywu (światło padające) lub także z boku, jak w przypadku szczelinowego mikroskopu ultradźwiękowego . Światło przechodzące i ciemne pole światła odbitego jest możliwe zarówno w "normalnych" mikroskopach, jak i stereomikroskopach .

Porównanie jasnego i ciemnego pola

Paper Micrograph Bright.png
Jasne pole
Paper Micrograph Dark.png
Ciemne pole


Rysunek 1: Włókna papieru z bibuły . Przy oświetleniu jasnym polem (po lewej) obraz mikroskopowy powstaje głównie w wyniku absorpcji światła w próbce, dzięki czemu włókna wydają się ciemniejsze niż tło. Natomiast w przypadku oświetlenia ciemnego pola tylko światło odchylone w preparacie tworzy obraz, dlatego włókna świecą na ciemnym tle.
Rycina 2: Odcisk palca na szkiełku mikroskopowym w różnych warunkach oświetleniowych, lewe jasne pole z otwartym kondensorem, obok niego z zamkniętym kondensorem i prawe oświetlenie ciemnego pola. Zarysowane sekcje są trzykrotnie powiększone na dole, aby zilustrować artefakty dyfrakcyjne na cząstkach i rysy spowodowane przez przesłonę kondensora, która jest zbyt mocno zamknięta na środkowym obrazie. Mocno zamknięta membrana skraplacza tworzy również rozproszone ciemne plamy, które powstają w wyniku zanieczyszczenia na spodniej stronie szklanej osłony. Ślady odcisków palców są najlepiej widoczne przy oświetleniu ciemnego pola, ale cząsteczki i rysy są prześwietlone.

Jasne i ciemne pole z oświetleniem przechodzącym

W mikroskopii oświetlenie przechodzące to układ, w którym oświetlenie następuje od tyłu preparatu widzianego z obiektywu, światło przechodzi przez preparat ( transmisja ) i ostatecznie dociera do obiektywu. Normalna mikroskopia w świetle przechodzącym, a dokładniej: mikroskopia w jasnym świetle przechodzącym, jest wariantem najczęściej stosowanym w biologii i medycynie, jest również stosowana w mikroskopach szkolnych.

W klasycznej mikroskopii jasnego pola w świetle przechodzącym kontrast obrazu powstaje głównie dzięki temu, że próbka pochłania część padającego światła, a odpowiedni obszar wydaje się ciemniejszy (patrz Rysunek 1). Jednak wiele mikroskopijnych obiektów jest w dużej mierze przezroczystych lub bardzo małych i dlatego pochłania bardzo mało światła. Generują one jedynie niski kontrast w mikroskopie z jasnym polem i dlatego są trudne do zauważenia na jasnym tle (patrz Rysunek 2 po lewej). Takie obiekty mogą odbijać światło, tj. zmieniać kierunek niektórych promieni świetlnych poprzez rozpraszanie , dyfrakcję , załamanie i/lub odbicie . Jednak te rozproszenia są trudne do wykrycia w jasnym oświetleniu pola, ponieważ jasność odchylonych promieni świetlnych jest znacznie słabsza niż jasno oświetlone tło obrazu. Kontrast można zwiększyć w pewnych granicach przy oświetleniu jasnym polem, wybierając mniejszą aperturę na ścieżce wiązki światła ( apertura kondensora ) (patrz Rysunek 2, środek). Jednocześnie jednak zwiększają się błędy obrazowania, a na krawędzi obiektów powstają zakłócające wzory dyfrakcyjne (porównaj małe przekroje obrazu na ryc. 2).

W przypadku mikroskopii ciemnego pola w świetle przechodzącym preparat jest oświetlany od tyłu w taki sposób, że światło nie dociera bezpośrednio do obiektywu, a jedynie światło odbite w preparacie. Tło obrazu wydaje się zatem ciemne, podczas gdy obiekty w próbce wydają się jasne (patrz Rysunek 1 po prawej). Działa to również, a zwłaszcza w przypadku próbek w dużej mierze przezroczystych. Podczas gdy różnice w jasności odchylonego światła są trudne do rozpoznania ze względu na dużą intensywność światła obrazu pola jasnego, różnice te wydają się znacznie silniejsze na obrazie pola ciemnego. Drobne ślady tłuszczu na odcisku palca na rysunku 2 (po prawej) są zatem wyraźnie widoczne. Zanieczyszczenia (cząstki i rysy), które są już widoczne w jasnym oświetleniu pola, wykazują tak silny kontrast w ciemnym polu, że są widoczne na obrazie tylko jako jasne, prześwietlone plamy.

W przypadku oświetlenia ciemnego pola w świetle przechodzącym szczególnie ważne jest, aby szkiełko, szkiełko nakrywkowe, a także powierzchnie szklane mikroskopu były czyste, ponieważ każde ziarnko kurzu, odbijając światło, przyczynia się do powstawania szumu tła. Ponadto struktury odbijające światło nie mogą pojawiać się w różnych płaszczyznach jedna na drugiej, ponieważ w przeciwnym razie ich sygnały nakładałyby się na siebie. W związku z tym oświetlenie ciemnego pola nie jest odpowiednie dla grubych próbek, takich jak typowe skrawki tkanek.

Pod względem fizycznym oświetlenie ciemnego pola w świetle przechodzącym można opisać jako oświetlenie, w którym główne maksimum dyfrakcyjne światła (patrz dysk dyfrakcyjny ) nie dociera do tylnej płaszczyzny ogniskowej soczewki. W strukturze obrazu bierze udział tylko światło odchylone, na przykład maksima wtórne spowodowane dyfrakcją.

Jasne i ciemne pole z oświetleniem padającego światła

Rysunek 3: Moneta 2 euro w jasnym polu światła odbitego (po lewej) i oświetleniu światłem odbitym w ciemnym polu (po prawej). Obraz ciemnego pola z odpowiednim oświetleniem pierścieniowym. O ile w jasnym polu powstaje prawidłowe wrażenie kolorystyczne, o tyle struktura mapy Europy jest znacznie lepiej widoczna w ciemnym polu.

W mikroskopii świetlnej oświetlenie światłem padającym stosuje się, gdy światło pada na preparat z góry (dokładniej: od strony soczewki). Oświetlenie odbywa się albo przez samą soczewkę, albo przez niezależne urządzenie oświetleniowe umieszczone z boku lub wokół soczewki. Kąt, pod jakim światło pada na obiekt, determinuje wygląd obrazu. Jeśli duża część światła odbitego przez preparat zostanie przechwycona przez obiektyw, obiekt wydaje się jasny na obrazie (jasne oświetlenie pola). Jeśli jednak oświetlenie jest tak daleko od boku, że kierunkowo odbite światło przechodzi przez soczewkę, określa się to jako oświetlenie ciemnego pola.

Podczas badania materiałów najczęściej stosowaną techniką do oświetlania szorstkich, mniej odblaskowych obiektów jest oświetlenie w jasnym polu. Oświetlenie padającego jasnego pola odpowiada normalnemu sposobowi widzenia ludzi: Gładkie, silnie odbijające powierzchnie wydają się jasne dzięki silnemu połyskowi (Rysunek 3 po lewej). Odbicie nadaje powierzchniom metalowym ich typowy połysk. Struktury ułożone pod szkłem lub innymi przezroczystymi powierzchniami byłyby trudne do zauważenia przy tego typu oświetleniu ze względu na silne odbicie na powierzchni.

W przypadku oświetlenia ciemnego pola światłem odbitym gładkie, silnie odbijające światło powierzchnie wydają się ciemne. Krawędzie i defekty powierzchni, takie jak zadrapania lub osady, świecą jednak jasno (rysunek 3 po prawej). Są one uwydatniane i można je łatwiej rozpoznać lub łatwiej wykryć za pomocą metod przetwarzania obrazu . W przypadku szorstkich, mniej odbijających powierzchni, boczne rozmieszczenie oświetlenia ciemnego pola światłem odbitym zapewnia lokalne tworzenie cieni, dzięki czemu struktury powierzchni wydają się nieco bardziej trójwymiarowe. Efekt ten można znacznie wzmocnić jednostronnym oświetleniem.

Mikroskopia ciemnego pola poza mikroskopią świetlną

Terminy ciemne pole i jasne pole mogą również być metodą mikroskopową, przenoszącą to na obrazowanie bez użycia światła, ale z innymi sygnałami. Dokonuje się odpowiedniego rozróżnienia, czy sygnał wzbudzenia , który nie jest odchylany, jest rejestrowany przez detektor (jasne pole), czy tylko sygnał zmieniony przez próbkę ma udział w obrazowaniu (ciemne pole). Istnieją procesy znane jako ciemne pola, na przykład w mikroskopii elektronowej (patrz na przykład skaningowy mikroskop transmisyjny ) oraz w mikroskopii akustycznej .

Oświetlenie ciemnego pola we współczesnych mikroskopach w świetle przechodzącym

Mikroskop ciemnego pola z centralną aperturą. Oświetlenie pochodzi z dołu i jest pokazane na żółto, środkowy obszar, zaciemniony przez ekran, jest ciemnoszary. 1 - membrana środkowa , 2 -  kondensor , 3 - lekki płaszcz stożka , 4 - płaszczyzna preparacji , 6 -  obiektyw .

Najłatwiejszym sposobem wygenerowania oświetlenia ciemnego pola za pomocą normalnego mikroskopu światła przechodzącego ze źródłem światła, kondensorem i soczewką z oświetleniem Koehlera jest ścisłe zamknięcie apertury kondensora, a następnie przesunięcie jej w bok, aż do momentu, gdy bezpośrednie światło przestanie przenikać przez soczewkę. Oświetlenie jest więc tylko z jednej strony. Jednak w szczególności nowsze mikroskopy często nie oferują możliwości przesuwania membrany względem kondensora.

Wspólne fundamenty

Lepszą jakość obrazu uzyskuje się dzięki wyśrodkowanemu kondensorowi za pomocą dodatkowego urządzenia. To dodatkowe urządzenie ogranicza oświetlenie preparatu do koperty stożkowej (żółtej na schemacie po prawej). Wewnętrzna część stożka nie zawiera światła (szare na schematycznym rysunku). Powierzchnia stożka wychodzącego z kondensora skupia się na płaszczyźnie próbki i, w najprostszym przypadku, ponownie się rozszerza, tak że nieodbite światło całkowicie omija otwór obiektywu, tło obrazu pozostaje ciemne. Tylko światło odchylone przez obserwowane obiekty wpada do obiektywu i tworzy obraz o jasnych strukturach na ciemnym tle. Całe dzisiejsze oświetlenie w świetle przechodzącym w ciemnym polu generuje powierzchnię stożkową, ale nie zawsze przechodzi przez całą preparację: w niektórych przypadkach dochodzi do całkowitego odbicia nieodbitego światła w górnej części szklanej osłony.

Do tworzenia obwiedni stożka oświetlenia wykorzystywane są dwie różne metody. Membrana centralna do wytwarzania płaszcza stożkowego jest łatwa w produkcji i użyciu, niedroga i dlatego szeroko rozpowszechniona. Metoda ta jest szczególnie odpowiednia dla obiektywów o stosunkowo małym powiększeniu, gdzie grubość osłony stożka oświetlającego może być optymalnie dopasowana do używanego obiektywu poprzez zwykłą zmianę przysłony. Specjalne kondensory ciemnego pola osiągają wyższą wydajność światła dzięki technologii lustrzanej i mogą również spełniać wymagania soczewek o większym powiększeniu dzięki zanurzeniu . Jakość obrazu jest coraz lepsza.

Jeżeli płaszcz stożka oświetlającego przechodzi przez próbkę, jak na schematycznym rysunku, musi wyjść poza obiektyw. Oświetlenie ciemnego pola jest możliwe tylko wtedy, gdy kąt padania światła z kondensora ( kąt otwarcia ) jest większy niż kąt padania światła przez soczewkę. Im większy kąt otwarcia obiektywu lub kondensora, tym lepsza maksymalna osiągalna rozdzielczość . Zamiast kąta otwarcia podano aperturę numeryczną dla obiektywów i kondensorów , która może wynosić do 0,95 bez zanurzenia i do około 1,4 z olejkiem imersyjnym. W przypadku oświetlenia ciemnego pola apertura numeryczna kondensora musi być wyższa niż apertura używanego obiektywu. Bez zanurzenia kondensora, zastosowanie jest zatem ograniczone do obiektywów o aperturze numerycznej około 0,75 lub mniej. Obiektywy 40x, które są używane bez immersji, często mają aperturę numeryczną 0,65.

Oświetlenie z ekranem centralnym

Płaszcz stożkowy do oświetlenia ciemnego pola, stworzony z centralnym ekranem. Kolorowy slajd został umieszczony pionowo w ścieżce wiązki w celu uwidocznienia ścieżki oświetlenia. Oświetlenie pochodzi z kondensora na dole i przechodzi przez soczewkę na górze. Do oglądania próbkę umieszcza się na stole tak, aby znajdowała się w najjaśniejszym punkcie.
Panel środkowy, widziany tutaj z góry, jest pośrodku nieprzezroczysty (czarny) i przeźroczysty na krawędzi (żółty).

W tym przypadku w normalnym mikroskopie pola jasnego w świetle przechodzącym stosuje się membranę pierścieniową. Ta środkowa przesłona (1 na górnym schematycznym rysunku po prawej stronie) ma półprzezroczystą krawędź lub pierścień, a tym samym redukuje oświetlenie za pomocą zwykłego kondensora (2) do stożka (3). W celu optymalnego wykorzystania kąta otwarcia kondensora stosuje się możliwie najdalej wysuniętą część kondensora. Im większy kąt otwarcia zastosowanej soczewki, tym większa musi być średnica centralnego obszaru nieprzezroczystego, a natężenie oświetlenia jest odpowiednio zmniejszone. Zaczynając od stolika preparatu ze szkiełkiem preparatowym (4), w ten sposób światło przechodzi przez obiektyw (6). Do obiektywu dociera tylko światło (5) odchylane przez struktury w preparacie. Środkową przesłonę można umieścić pod soczewką kondensora zwykłego mikroskopu światła przechodzącego.

Bardziej rozpowszechniona mikroskopia z kontrastem fazowym opiera się na zupełnie innym zjawisku optycznym, ale stosuje się tam również przesłony. Te membrany pierścieniowe mogą czasami być używane do innych celów jako membrany ciemnego pola. Pierścieniowe przesłony kontrastu fazowego są zaprojektowane w taki sposób, że stożek światła wchodzi do obiektywu, gdy jest prawidłowo ustawiony i nie przechodzi obok niego, jak jest to konieczne w przypadku ciemnego pola. Dlatego w przypadku danego obiektywu tylko te przesłony pierścieniowe z kontrastem fazowym mogą być używane jako przesłony ciemnego pola, które są faktycznie przeznaczone do obiektywów o znacznie większym kącie otwarcia (większa apertura numeryczna). Na przykład, pierścieniowa przesłona kontrastu fazowego dla obiektywów immersyjnych 100x jest zwykle odpowiednia jako przesłona ciemnego pola dla obiektywów suchych 10x i 20x, ponieważ obiektywy immersyjne mają większy kąt apertury.

Kondensatory ciemnego pola

Kondensor ciemnego pola na rysunku z 1910 roku. Tor wiązki jest podobny do tego w bardziej nowoczesnym kondensatorze kardioidalnym. Dodawane są czerwone i zielone linie, aby podświetlić ścieżkę wiązki pokazaną w oryginale. Światło wnika do szklanego korpusu od dołu i jest początkowo odbijane na zewnątrz na wypukłej lustrzanej powierzchni. Tam spotyka się z wklęsłą lustrzaną powierzchnią, która kieruje promienie w kierunku preparatu (P) . Suwak (Q) leży bezpośrednio na skraplaczu (podłączonym do olejku immersyjnego), tak aby promienie przebiegały tutaj na wprost. Światło, które nie jest odchylane w próbce, omija soczewkę. Na tym rysunku ma to miejsce tylko w przypadku zielonej wiązki, jeśli nie ma cieczy zanurzającej między szkiełkiem nakrywkowym a obiektywem: następnie zostaje przerwana na granicy szkiełka nakrywkowego-powietrze w taki sposób, że nie dochodzi do obiektywu.

Jeśli wymagania dotyczące jakości obrazu są szczególnie wysokie, zamiast środkowych przesłon stosuje się specjalne kondensory ciemnego pola. Istnieją suche kondensory ciemnego pola oraz immersyjne kondensory ciemnego pola , w tym ostatnim przypadku pomiędzy kondensorem a szkiełkiem umieszczany jest olejek imersyjny lub woda. Umożliwia to wyższą aperturę numeryczną, a tym samym wyższą rozdzielczość. Kondensor immersyjny zapewnia również lepszy kontrast, ponieważ unika się odbić na spodniej stronie slajdu i powierzchni kondensora, które prowadzą do rozjaśnienia tła obrazu. Jednak obsługa jest bardziej skomplikowana, również dlatego, że olej wymaga starannego czyszczenia. Wadą obu typów kondensora ciemnego pola w porównaniu z przesłoną centralną jest bardziej złożona zmiana na oświetlenie jasnego pola, ponieważ w tym celu należy wymienić kondensor. Kondensory suchego ciemnego pola nadają się do obiektywów z aperturą numeryczną do 0,65 lub 0,75, podczas gdy kondensorów imersyjnych można używać do obiektywów z aperturą numeryczną do 1,2.

Nowoczesne kondensatory ciemnego pola to w większości kondensatory kardioidalne. Tutaj wypukłe zakrzywione zwierciadło centralne kieruje padające światło na zewnątrz na biegnące wokół niego wklęsłe zwierciadło , tak że powstaje powierzchnia stożka (patrz porównywalny rysunek z 1910 po prawej). Lustro wklęsłe idealnie ma powierzchnię w kształcie kardioidy , stąd nazwa. Jednak ze względów produkcyjnych powierzchnia ta jest zaprojektowana jako powierzchnia sferyczna, co nie prowadzi do znaczącej utraty jakości. Z kolei skraplacz paraboloidy ma kształt paraboloidy ściętej . Światło jest tutaj odbijane tylko raz, a mianowicie przez całkowite odbicie (patrz rysunek paraboloidy szklanej Wenhama poniżej), co z kolei tworzy dookoła stożek oświetleniowy.

Aby zapewnić, że apertura numeryczna obiektywu jest mniejsza niż apertura kondensora, można również zastosować obiektyw, w którym aperturę numeryczną można ograniczyć za pomocą ruchomej przesłony irysowej. Kąt otwarcia soczewki można zatem optymalnie dopasować do średnicy stożka świetlnego, aby móc go po prostu ukryć.

Kondensatory kardioidalne i paraboloidalne nazywane są też kondensorami katoptrycznymi ciemnego pola , ponieważ w nich światło jest odbijane przez odbicie, podczas gdy w tzw. kondensorach dioptrycznych robią to soczewki szklane.

Przepuszczane jasne ciemne pole w mikroskopach stereoskopowych

Dla mikroskopów stereoskopowych dostępne są również iluminacje w zakresie światła przechodzącego w ciemnym polu. Urządzenie oświetleniowe jest umieszczone w podstawie stojaka. Oprócz rzeczywistego źródła światła, m.in. B. do oświetlania obiektu bańką stożkową stosuje się lampę halogenową , klosz centralny oraz zewnętrzne, pionowe powierzchnie odbijające. Zasada odpowiada z grubsza opisanemu powyżej kondensatorowi lustrzanemu. Obiekt umieszczony jest na szklanej płytce, która zamyka podstawę stojaka od góry. Obraz składa się z promieni świetlnych, które zostały ugięte w obiekcie w wyniku odbicia , załamania lub dyfrakcji światła . Zazwyczaj osłona centralna może być wymieniona na szkło szlifowane, dzięki czemu oprócz pola ciemnego możliwe jest również oświetlenie pola jasnego przechodzącego przez światło. Zwierciadła na zewnątrz kierują wtedy na preparat pod kątem tyle samo światła, co poprzednio, ale ze względu na znacznie jaśniejsze oświetlenie jasnego pola nie prowadzi to już do widocznych efektów.

Stereo.jpg
StereoHF.jpg
StereoDF.jpg


Mikroskop stereoskopowy firmy Wild Heerbrugg z jasnym polem światła przechodzącego i urządzeniem do oświetlenia ciemnego pola światła przechodzącego w podstawie urządzenia. Przy jasnym oświetleniu pola (w środku) światło jest równomiernie rozprowadzane przez matową szybę. W przypadku oświetlenia ciemnego pola (po prawej) centralny ekran osłania bezpośrednią ścieżkę od źródła światła do preparatu. Oświetlenie w kształcie muszli stożkowej odbywa się tylko za pośrednictwem dziesięciokątnego lusterka zewnętrznego. Okrągła płytka szklana, na której umieszczane są próbki, została usunięta z dwóch prawych obrazów.

Wcześniejsze podejścia do obserwacji w świetle przechodzącym w ciemnym polu

przed 1900

Oświetlenie według Reade (1837), opisane przez Queckett, 1852. Po lewej stronie pokazano źródło światła d , soczewkę kondensora c , a po prawej stół przedmiotowy ab z preparatem e , ale bez obiektywu i innych elementów mikroskopu.
Szklana paraboloida Wenhama na ilustracji P. Hartinga (1859). Oświetlenie jest od dołu, soczewka znajduje się nad tym układem. Kolejno dodane czerwone i zielone linie wyjaśniają narysowaną przez Wenhama drogę wiązki z całkowitym odbiciem na szkle osłonowym i oświetleniem obiektu od góry. off , szkiełko nakrywkowe. AB , szkiełko mikroskopowe. C , przekrój paraboloidy szklanej. cd , poczerniała płyta zapobiegająca bezpośredniemu przechodzeniu światła. W punkcie o próbka znajduje się między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym.

Już w XVII wieku mikroskopię ciemnego pola wykorzystali Antoni van Leeuwenhoek , Robert Hooke i Christiaan Huygens do obserwacji składników krwi lub małych organizmów. Nie użyto jednak żadnego specjalnego sprzętu. Zamiast tego źródło światła, takie jak świeca, zostało ustawione tak, aby na soczewkę nie padało żadne bezpośrednie światło.

Mikroskopia ciemnego pola jest możliwa nawet przy bardzo pochylonym zwierciadle oświetlającym. Pierwszym, który opisał specjalną aparaturę do oświetlania ciemnego pola, był Joseph Bancroft Reade (1801-1870) w 1837 roku , którego metoda została wymieniona w „Praktycznym traktacie o użyciu mikroskopu” Johna Quecketta z 1852 roku jako oświetlenie tła . Źródło światła umieszczono z boku, soczewka skupiająca skupiała światło na preparacie w taki sposób, aby nieodbite światło było kierowane poza obiektyw. W XIX wieku wielu autorów opracowało dodatkowy sprzęt oświetleniowy. Ponieważ załamanie na powierzchni szkła powoduje aberrację chromatyczną , która jest szczególnie niepokojąca w mikroskopii ciemnego pola, opracowano również kondensatory lustrzane, ponieważ błąd ten nie występuje przy odbiciu . Odbicie uzyskano albo przez powierzchnie odbijające, albo przez całkowite odbicie .

Francis Herbert Wenham (1824-1908) opisał różne zasady oświetlenia ciemnego pola w kilku pracach w latach 1852-1856. Oprócz oświetlenia bocznego (o efekcie podobnym do tego z Reade), zawierał również kondensatory dla centralnie umieszczonego źródła światła, w tym wydrążoną, posrebrzaną paraboloidę i pełną szklaną paraboloidę, w której odbicie powstało w wyniku całkowitego odbicia ( patrz ilustracja). Szkiełko stykało się bezpośrednio z chłodnicą. Preparat zatopiono w balsamie kanadyjskim lub płynie. Między szkiełkiem nakrywkowym a obiektywem było powietrze. Zasada dyfrakcji , która jest niezbędna do efektywnego oświetlania ciemnym polem małych obiektów, nie była wówczas jeszcze rozumiana. Wenham założył zatem, że obserwowane efekty były spowodowane faktem, że obiekt był oświetlony z góry, a mianowicie światłem, które zostało odbite z powrotem na próbkę przez całkowite odbicie od górnej krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Od około 1900

Do końca XIX wieku mikroskopia ciemnego pola była używana przez amatorów, ale mało w dziedzinie nauki, ponieważ nie działała z obiektywami o wyższej rozdzielczości (z dużą aperturą numeryczną ). Dzięki pracy Ernsta Abbe pod koniec XIX wieku zrozumiano podstawy optyczne, takie jak dyfrakcja . W. Gebhardt z Zeiss skorzystał z tego , proponując centralny ekran dla aparatu oświetleniowego Abbego do oświetlenia ciemnego pola, który Zeiss dodał do swojej oferty w 1898 roku. Jeśli zastosowano zanurzenie między kondensorem a szkiełkiem, można zastosować suche obiektywy o aperturze do 0,95. Czasami ten centralny panel był dostarczany ze wszystkimi odpowiednimi urządzeniami, ale ponieważ nie został zbyt dobrze przyjęty przez klientów, zaprzestano jego produkcji. Podobne rozwiązanie zaproponowała wiedeńska firma Reichert, zajmująca się mikroskopami.

Wraz z odkryciem patogenu kiły , od 1906 roku mikroskopia ciemnego pola doświadczyła ożywienia, ponieważ umożliwiła dobrą reprezentację żywych krętków , do których należy patogen. Kilka dużych firm zajmujących się mikroskopami opracowało ulepszone kondensatory ciemnego pola. Ten Karla Reicherta zawierał centralny otwór o zmiennej wielkości. Henry Siedentopf opracował kondensator paraboloidalny dla Zeissa w 1907 roku . Chociaż konstrukcja odpowiadała paraboloidowi ze szkła Wenhama z zaciemnieniem pośrodku dolnej strony paraboloidy, jakość optyczną można było poprawić dzięki ulepszonym technikom produkcyjnym, tak aby wewnętrzne i zewnętrzne otwory osłony stożka oświetlającego miały 1,1 i 1,4. Na podstawie pracy Abbego było jasne, że dyfrakcja odgrywa decydującą rolę w tworzeniu obrazu, a całkowite odbicie na szkle osłonowym pomaga jedynie uniknąć wnikania nieodbitego światła do soczewki. W późniejszej wersji tzw. kondensor pola jasnego i ciemnego , centralne zaciemnienie można było usuwać za pomocą dźwigni, dzięki czemu możliwa była szybka zmiana pola ciemnego na jasne.

Opisane dotychczas podejścia opierają się na fakcie, że próbka jest oświetlana z większą aperturą numeryczną, to znaczy pod szerszym kątem, niż może być zarejestrowany przez obiektyw. Możliwe jest jednak również odwrotne podejście: próbka jest oświetlana pełnym stożkiem o małej aperturze numerycznej (na przykład 0,2). Można tu również zastosować obiektywy o wysokiej rozdzielczości, ponieważ apertura numeryczna, a co za tym idzie kąt otwarcia, może mieć dowolny rozmiar, ale muszą być znacznie większe niż oświetlenie. Światło, które nie jest odbijane w preparacie, zajmuje wówczas tylko centralny obszar obiektywu, podczas gdy obszar zewnętrzny pozostaje wolny od bezpośredniego światła oświetlającego. Nieodbite światło jest następnie quasi usuwane w soczewce lub za nią w odpowiednim punkcie toru wiązki. Nazywano to „układem współosiowym” lub „ciemnym polem centralnym” i zaliczano je do metod ultramikroskopowych (patrz poniżej). Wadą tego podejścia jest to, że w próbce uzyskuje się znacznie wyższe natężenia światła niż na przykład w przypadku przesłony centralnej w kondensorze, co skutkuje zakłóceniami wtórnych obrazów dyfrakcyjnych w próbkach z wieloma obiektami.

Do opracowanego przez siebie systemu Henry Siedentopf użył soczewki, w której półkulisty tył przedniej soczewki (pierwszy szklany korpus w soczewce) był szlifowany na płasko i pomalowany na czarno. Carl Metz (1861–1941) w Leitz opracował w 1905 roku system z obiektywami immersyjnymi w oleju, w którym przesłona stemplowa (także: przesłona lejkowata) była wsuwana ruchomo od tyłu do obiektywu. Umożliwiło to użycie tego samego obiektywu bez tej przysłony do zastosowań w jasnym polu bez utraty jasności. Trudno było do tego przystosować.

„Trumna Leitz”, pierwsze logo Leitz

Wladimir Sergejewitsch Ignatowski opracował dla Leitza kondensator ciemnego pola, który miał dwie powierzchnie odbijające, ale był łatwiejszy w obsłudze niż wcześniejsze odpowiadające im modele (patrz schemat z 1910 powyżej). Sprzedawany był od 1907 roku. Przekrojowy rysunek następcy modelu opracowany przez Felixa Jentzscha z 1910 roku stał się szablonem dla logo Leitza , tzw. trumny Leitza.

Henry Siedentopf w firmie Zeiss zaprojektował również kondensor z dwiema powierzchniami odbijającymi, który był bardzo podobny do kondensora opracowanego przez Ignatowskiego. Ze względów teoretycznych druga powierzchnia odbijająca powinna odpowiadać wycinkowi kardioidy . Powierzchnie kardioidalne były trudne do wytworzenia. Zamiast tego zastosowano powierzchnię kulistą, która dała ten sam efekt w granicach tolerancji produkcyjnych. Mimo to, urządzenie zostało wprowadzone na rynek przez firmę Zeiss jako kondensator kardioidalny .

Przegląd zalet i wad oświetlenia pola ciemnego w świetle przechodzącym

Zalety:

  • Małe, nawet niezabarwione obiekty można obserwować z silnym kontrastem, szczególnie dobrze w niskich stężeniach przy cienkich próbkach.
  • Obiekty poniżej limitu rozdzielczości również powodują sygnały, jeśli oświetlenie jest wystarczająco silne.
  • Niektóre formy oświetlenia ciemnego pola, szczególnie przy małym powiększeniu, mogą być realizowane bardzo łatwo i bez znacznych kosztów.
  • W przeciwieństwie do oświetlenia pola jasnego, przy oświetleniu pola ciemnego nie występują zjawiska entoptyczne, smugi, które powstają w samym oku i rzucają cienie na siatkówkę.

Niekorzyść:

  • Powierzchnie obiektów wywołują sygnały ze względu na zmianę współczynnika załamania, ale nie jednorodne wnętrze, tak że na obrazie widać wtedy tylko granicę.
  • Technika ta nie jest odpowiednia dla grubych preparatów lub preparatów z wieloma obiektami, ponieważ zbyt wiele sygnałów, na przykład z różnych poziomów ostrości, przeciwdziała efektowi ciemnego pola.
  • Zanieczyszczenia na drodze wiązki prowadzą również do zakłóceń sygnałów, dlatego wymagania dotyczące czystości urządzenia i przygotowania są bardzo wysokie.
  • W przypadku wyższych wymagań wymagane są specjalne kondensory, ponieważ odbicia między różnymi soczewkami w normalnych kondensorach zmniejszają efekt ciemnego pola.
  • Ponieważ kąt otwarcia kondensora lub obiektywu musi zostać zmniejszony, rozdzielczość jest zmniejszona w porównaniu z jasnym polem i innymi metodami zwiększania kontrastu, takimi jak kontrast fazowy i kontrast interferencji różnicowej

Oświetlenie Rheinberg

Schemat oświetlenia Rheinberga, porównaj oświetlenie ciemnego pola z centralnym ekranem powyżej.
Rheinberg 6.jpg
Rheinberg 2 diatom.jpg
Okrzemki pod oświetleniem Rheinberga. W przypadku wielkich liter kolory na ścieżce wiązki odpowiadają schematycznemu rysunkowi po lewej stronie. Poniżej kolejny preparat okrzemkowy pobrany innym filtrem.

Oświetlenie Rheinberga (też: kolorowanie optyczne lub oświetlenie barw kontrastowych) jest modyfikacją mikroskopii ciemnego pola z centralną aperturą, którą po raz pierwszy opisał w 1896 roku w Londynie Julius Rheinberg . Centralny sito zastąpiono okrągłym filtrem z dwoma kolorami w układzie koncentrycznym : jeden kolor tworzy pierścień zewnętrzny, odpowiada on pierścieniowi w konwencjonalnym sicie pierścieniowym. Przechodzące przez nią światło wpadnie do soczewki tylko wtedy, gdy zostanie odbite w próbce. Drugi kolor znajduje się pośrodku, inaczej nieprzezroczysty obszar. Określa tło obrazu. W ten sposób powstają bardzo atrakcyjne estetycznie obrazy bez widocznych dodatkowych struktur.

Pod nazwą Mikropolychromar firma Zeiss dostarczała akcesoria do kondensatorów około 1939 roku aż do okresu po II wojnie światowej, dzięki czemu oświetlenie firmy Rheinberg było możliwe. Centralne jasne pole i zewnętrzne ciemne pole mogą być różnie zabarwione za pomocą filtrów. Zeiss polecił to urządzenie „aby ułatwić badanie obiektów bezbarwnych o niskim kontraście”. Gerlach (2009) pisał o tym udogodnieniu, że „z pewnością miało ono pewne znaczenie przed wprowadzeniem metody kontrastu fazowego”. Firma Reichert sprzedawała rozwiązanie oparte na kondensatorze lustrzanym pod nazwą Optikolor , co umożliwiło również oświetlenie firmy Rheinberg.

Dzięki trójkolorowym filtrom Rheinberg preparaty o wyraźnej strukturze mogą być prezentowane szczególnie skutecznie. Zewnętrzny pierścień filtra jest podzielony na cztery kąty 90°, przeciwległe ćwiartki są pokolorowane w ten sam sposób, ale sąsiednie ćwiartki są pokolorowane inaczej. Wewnętrzny okrąg jest pokolorowany trzecim kolorem. Dwukolorowy pierścień zewnętrzny oznacza, że ​​struktury rozpraszające się od lewej do prawej są wyświetlane w innym kolorze niż te, które rozpraszają się od przodu do tyłu na płaszczyźnie próbki. Przykładami takich preparatów są okrzemki lub tkaniny tekstylne .

Oświetlenie ciemnego pola w mikroskopach światła odbitego

Klasyczna mikroskopia ciemnego pola odbitego światła

Światło padające Oświetlenie ciemnego pola. Płaszcz świetlny (1) jest prowadzony przez lustro (2) w zewnętrznej części specjalnej soczewki i tam odbijany (3) tak, że światło oświetla próbkę (4) osłoną stożka. Soczewki w obiektywie (turkusowe) pochłaniają światło (oliwkowy brąz), które jest odbijane na powierzchni preparatu.

W mikroskopii światła odbitego światło jest emitowane z tej samej strony, z której jest obserwowane. Metodę tę stosuje się do materiałów nieprzezroczystych, na przykład minerałów lub testów materiałowych . Przy oświetleniu jasnym polem światła padającego oświetlenie może być zasilane tą samą drogą wiązki obiektywu, która jest również używana do obserwacji.

Jednak w przypadku oświetlenia ciemnego pola światłem odbitym, tory oświetlające i obserwacyjne są oddzielone: ​​Soczewki specjalne mają dodatkowy obszar zewnętrzny, który jest zarezerwowany dla toru wiązki oświetlającej (patrz schemat). Obszar wewnętrzny odpowiada normalnej soczewce, przy oświetleniu ciemnego pola służy wyłącznie do obserwacji. Obszar zewnętrzny odpowiada skraplaczowi. Tutaj światło (1 na rysunku) jest kierowane ukośnie na próbkę (4) przez pierścieniowe zwierciadło wklęsłe w obszarze zewnętrznym (3). Gdyby próbka była płaskim lustrem, odbite tam światło całkowicie omijałoby wewnętrzną powierzchnię soczewki: obraz pozostawałby ciemny. Z drugiej strony światło odchylane przez struktury powierzchni, takie jak rysy, jest odbierane przez soczewkę (5).

W przypadku niektórych soczewek ciemnego pola światła odbitego możliwe jest pokazanie lub ukrycie poszczególnych sektorów pierścienia oświetleniowego. Może to zintensyfikować powstawanie cieni, dzięki czemu struktury biegnące w określonych kierunkach mogą być lepiej rozpoznane. Dzięki tak zwanym urządzeniom oświetleniowym Ultropak, „kondensor”, który jest przymocowany do obiektywu, można regulować na wysokość, aby maksymalnie oświetlić różne poziomy preparatu. Przy małych powiększeniach wymagane natężenie światła można również osiągnąć za pomocą zewnętrznego źródła światła ustawionego z boku, na przykład lamp światłowodowych .

Struktury powierzchniowe takie jak rysy wyraźnie odstają od tła w ciemnym polu światła odbitego, ponieważ światło odbite lub rozproszone na nich jest częściowo kierowane w centralny obszar soczewki. Takie struktury są więc jasne na ciemnym tle obrazu. W związku z tym oświetlenie ciemnego pola światłem odbitym nadaje się szczególnie do badania powierzchni, na przykład w materiałoznawstwie . Oświetlenie ciemnego pola jest szeroko rozpowszechnione w mikroskopach światła odbitego. W przeciwieństwie do światła przechodzącego w ciemnym polu, oświetlenie ciemnego pola w świetle odbitym może być również używane z najmocniejszymi obiektywami. Aby uniknąć niepożądanych odbić, jeśli to możliwe, pracuj bez szkiełka nakrywkowego.

Odbite jasne ciemne pole w mikroskopach stereoskopowych

W przypadku mikroskopów stereoskopowych można zastosować ciemne pole światła odbitego, ponieważ oświetlenie ma tendencję do ocierania się o powierzchnię, a kierunkowo odbite światło nie dociera bezpośrednio do obiektywu. Jest to możliwe na przykład poprzez lekkie przechylenie płaskiego preparatu lub sprytne rozmieszczenie dowolnie pozycjonowanych źródeł światła (np. oświetlenie typu „gęsia szyja” z długim, elastycznym uchwytem). Do okrągłego oświetlenia w ciemnym polu w kształcie pierścienia stosuje się na przykład specjalne lampy pierścieniowe o kącie wiązki 60 °, które są umieszczone w niewielkiej odległości zaledwie 5–15 mm nad próbką. Dołączony adapter ciemnego pola (tuba o regulowanej wysokości) umożliwia montaż na obiektywie i zapobiega rozproszonemu światłu. Przykładem próbki zarejestrowanej przy takim oświetleniu jest obraz prawej monety o nominale 2 euro w powyższym przekroju jasne i ciemne pole przy oświetleniu światłem padającym . W mikroskopach stereoskopowych, oświetlenie ciemnego pola światłem odbitym jest czasami postrzegane jako standardowy rodzaj oświetlenia.

W przypadku mniej odblaskowych obiektów obraz ciemnego pola tworzy mniej lub bardziej trójwymiarową reprezentację w zależności od kąta padania. Ekstremalne warunki ciemnego pola można osiągnąć za pomocą światła liniowego, które tworzy pasmo światła, które przesuwa się po powierzchni z jednej strony pod wyjątkowo płaskim kątem oświetlenia. Powstawanie cieni skutkuje bardzo wysokim kontrastem obrazów, nawet przy niewielkich różnicach wysokości. Odciski palców można łatwo wyświetlić na płaskich, równych powierzchniach.

Obrazowanie ciemnego pola w strumieniu bocznym

Rysunek schematyczny urządzenia do obrazowania w ciemnym polu Sidestream, poniżej obszaru z soczewką i jednostką oświetleniową
Przedstawienie mikrokrążenia za pomocą obrazowania ciemnego pola bocznego. Naczynia krwionośne są ciemne na jasnym tle, ponieważ światło jest w nich pochłaniane.

Obrazowanie ciemnego pola bocznego (w skrócie SDF, w języku niemieckim: Obrazowanie ciemnego pola bocznego) to metoda badania mikrokrążenia , czyli badania małych i bardzo małych naczyń krwionośnych . Zabieg wykonuje się za pomocą niewielkiego urządzenia, za pomocą którego takie naczynia można badać u pacjentów, np. pod językiem, gdzie nie ma przeszkadzających warstw skóry. Technika wykorzystuje centralny światłowód, w którym soczewka rzutuje obraz próbki na chip kamery. Światło z zielonych diod elektroluminescencyjnych ( długość fali 530 nm) jest napromieniowane na próbkę z pierścienia wokół środkowego światłowodu .

Rozproszenie w próbce powoduje równomierne rozłożenie światła w obserwowanym obszarze, dzięki czemu powstaje swoiste oświetlenie tła. Hemoglobiny w krwinkach czerwonych absorbuje światło zielone bardzo mocno, tak że naczynia krwionośne, które są gęsto wypełnione czerwonych krwinek, wyróżniają się jako ciemne struktur na jasnym tle. Maksymalna głębokość wnikania w tkankę to 500 mikrometrów.

Wykrywanie submikroskopowych cząstek

Podstawy optyczne

Wycinek tkanki po hybrydyzacji radioaktywnego RNA in situ i wykryciu radioaktywności poprzez tworzenie ziaren srebra. Pod mikroskopem w jasnym polu (po lewej) nie widać ziaren srebra, ponieważ są one zbyt małe, aby zaabsorbować wystarczającą ilość światła. Z drugiej strony, w tej samej sekcji obrazu z mikroskopią ciemnego pola (po prawej) wyraźnie pojawiają się jako jasne sygnały, na przykład pod strzałką w t. Skala ma długość 100 µm.

W mikroskopii ciemnego pola siła sygnału nie zależy od wielkości konstrukcji, ale od tego, jak mocno odbija się od niej światło. Dlatego, podobnie jak mikroskopia fluorescencyjna , może być również stosowany do wykrywania niektórych cząstek lub struktur, które są mniejsze niż granica rozdzielczości odpowiedniego mikroskopu. W tym przypadku nie jest jednak możliwe rozróżnienie, czy sygnał pochodzi z jednej, czy z kilku znajdujących się blisko siebie struktur. Nie ma też obrazu, ale zjawisko dyfrakcji zwane funkcją rozproszenia punktów , którego wielkość z kolei zależy od rozdzielczości mikroskopu.

Kształt cząstek (okrągły, wydłużony, kanciasty...) nie ma znaczenia dla kształtu i wielkości generowanego zjawiska dyfrakcji, tak że nie można określić kształtu cząstek. Jednak w przypadku mniejszych cząstek intensywność maleje, ponieważ odbija się od nich mniej światła. Dlatego wymagane jest dla nich mocne oświetlenie. Intensywność zależy również od różnicy gęstości optycznej ( współczynnika załamania światła ) pomiędzy strukturą a otaczającym ośrodkiem, ponieważ więcej światła jest odbijane z większymi różnicami współczynnika załamania.

Przykłady

Oświetlenie ciemnego pola wykorzystywane jest w eksperymencie Millikana , w którym technika ciemnego pola umożliwia obserwację kropel oleju w kondensatorze . Robert Millikan otrzymał w nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 1923 roku do ustalania elementarny ładunek z elektronu za pomocą tego eksperymentu .

Mikroskopia ciemnego pola może być również stosowana do wykrywania cząstek metalu w skrawkach tkanek (patrz także rysunek).

Ultramikroskopia

Około 1900 roku termin „ultramikroskopia” został użyty do opisania mikroskopowego badania ciemnego pola tzw. „ultramikronów”, cząstek mniejszych niż granica rozdzielczości światła, tj. mniejszych niż 0,2 mikrometra . Minimalna wielkość takich cząstek, która została określona już w 1902 roku przy jasnym świetle słonecznym w złotych rubinowych szkłach za pomocą ultramikroskopu, wynosi mniej niż cztery nanometry .

Do badania koloidów użyto szczelinowego mikroskopu ultradźwiękowego opracowanego przez Henry'ego Siedentopfa i Richarda Zsigmondy'ego , który nie nadawał się do badań biomedycznych. Oświetlenie odbywało się w formie płaszczyzny sprzężonej z bokiem preparatu, podobnie jak w bardziej nowoczesnej technologii optycznej mikroskopii dyskowej (SPIM), w której wykorzystuje się lasery i można również wzbudzać fluorescencję. Aby stworzyć płaszczyznę, przed źródłem światła umieszczono szczelinę z ultramikroskopem, której krawędzie dzieliły zaledwie kilka setnych milimetra. Luka ta została zmniejszona około 50 razy przy użyciu systemu soczewek i ostatecznie zobrazowana w próbce. Zeiss firma oferowane szczelina ultradźwiękowych mikroskopów oraz akcesoriów w roku 1910 dla 474.50  znaków (dla koloidów w cieczach) lub 744.50 znaków (koloidów w materiałach stałych). Aby móc obserwować w szczególności nanocząstki w cieczach i badać ich zachowanie, Richard Zsigmondy wraz z R. Winkel GmbH opracował w Getyndze szczelinowy mikroskop ultradźwiękowy, aw 1912 zaprezentował immersyjny mikroskop ultradźwiękowy.

Zupełnie inną geometrię oświetlenia zastosowano w uproszczonym ultramikroskopie opracowanym przez Cottona i Mouton w 1903 roku. Stożek światła podawano do szklanego pryzmatu z równoległobocznymi powierzchniami bocznymi. Na spodzie szklanego korpusu powstało całkowite odbicie , które doprowadziło światło do preparatu. Suwakowy został umieszczony bezpośrednio w masie szklanej z zanurzenia. Promienie światła padały na preparat pod takim kątem, że całkowite odbicie powstało również na górnej krawędzi szkiełka nakrywkowego, a bezpośrednie światło nie padało na obiektyw. Zarejestrowano tylko światło ugięte w próbce. Taki układ nie mógł być używany z obiektywami zanurzeniowymi, ponieważ w przeciwnym razie nie byłoby całkowitego odbicia na szkiełku nakrywkowym.

Inne zastosowania

Krętki z gatunku Borrelia burgdorferi , zarejestrowane przy oświetleniu w ciemnym polu. Skala odpowiada 8 µm po lewej stronie i 25 µm po prawej stronie.
Zarodki danio pręgowanego w oświetleniu w ciemnym polu. Oba zostały poddane obróbce cieplnej. W lewym zarodku ze zmianą w określonym genie , uszkodzenie wzrostu pozostaje w rozgraniczeniu segmentów ciała (powyżej grotu strzałki), co można określić przez brak rozgraniczenia przy oświetleniu ciemnym polem, po prawej normalny zarodek dla porównanie.

Ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopu pola ciemne w porównaniu do innych metod, takich jak poprawa kontrastu kontrastu fazowego lub różnicowej przeciwieństwie do zakłóceń , to tylko znaczenie dla kilku specjalnych zastosowań w biologii i medycynie dzisiaj . (Patrz zdjęcia po prawej stronie, aby zapoznać się z przykładami z prac badawczych z 2007 i 2008 r.) Na przykład nadal jest używany do mikroskopowego wykrywania niektórych patogenów w mikrobiologii klinicznej , takich jak krętki . Zdolność do wykrywania struktur submikroskopowych może być wykorzystana do badania izolowanych organelli i polimerów, takich jak wici , rzęski , mikrotubule i włókna aktynowe .

W przemyśle półprzewodnikowym mikroskopia odbitego światła ciemnego pola jest wykorzystywana do badania powierzchni płytek w celu znalezienia cząstek brudu. Takie badania wykonuje się z obiektywami suchymi (tj. bez zanurzenia ), granica rozdzielczości wynosi tu około 0,35 mikrometra . Jednak dzięki oświetleniu ciemnego pola widoczne są również cząstki, które spadają poniżej tego limitu.

W metalografii większość badań mikrosekcyjnych wykonuje się w jasnym polu. Ponadto ciemne pole można wykorzystać do wizualizacji mechanicznych defektów powierzchni (zarysowania, pęknięcia, wtrącenia, pory , wgłębienia lub wyrwy ) oraz do badania granic ziaren na wytrawionych przekrojach . Kolory wtrąceń ( siarczków lub tlenków ) są wyraźniejsze w ciemnym polu niż w jasnym, dzięki czemu przyporządkowanie jest łatwiejsze.

Ze względu na estetyczne obrazy, mikroskopia ciemnego pola stała się bardziej rozpowszechniona wśród mikroskopów amatorów. Dzięki niemu można na przykład zaobserwować przezroczyste mikroorganizmy wodne ( plankton ) (patrz pierwsze zdjęcia artykułu i linki do stron internetowych ).

Medycyna alternatywna

Zastosowanie mikroskopii ciemnego pola w medycynie alternatywnej jako metody diagnostycznej do badań krwi ma na celu wykrycie dużej liczby chorób. Często po tym następuje sprzedaż suplementów diety i innych środków terapeutycznych do leczenia rzekomo zdiagnozowanych chorób. Technika diagnostyczna opiera się na założeniu, że niektóre choroby powodują widoczne zjawiska świeżej krwi (na przykład agregację erytrocytów). Metoda ta nie jest ani wiarygodna, ani wiarygodna, stawia się diagnozy fałszywie dodatnie lub ujemne.

Według Günthera Enderleina ( izopatia ) mikroskopia ciemnego pola powinna umożliwić wczesne wykrycie raka. Proces opiera się na nieuzasadnionych naukowo założeniach dotyczących morfologii mikroorganizmów (tzw. pleomorfizm ). Badania naukowe z 2005 roku wykazały, że mikroskopia ciemnego pola nie nadaje się do wykrywania raka.

Innym alternatywnym medycznym badaniem krwi, które przeprowadza się przy użyciu mikroskopii ciemnego pola, jest badanie ciemnego pola krwi von Brehmera . To pochodzi od farmaceuty Wilhelma von Brehmera i ma również umożliwić wczesne wykrycie raka. Nie ma jednak dowodu przydatności. To badanie krwi wyszukuje Propionibacterium acnes (alias Siphonospora p. ), który jest typowym składnikiem flory skóry i może łatwo zanieczyścić rozmaz jako część próbki krwi.

linki internetowe

Commons : Obrazy  mikroskopowe w ciemnym polu — kolekcja obrazów wykonanych za pomocą mikroskopii w ciemnym polu

Indywidualne dowody

  1. ↑ a b c d e f D. Gerlach: mikroskopia świetlna . S. 13-85 . W: Horst Robenek (red.): Mikroskopia w badaniach i praktyce . GIT-Verlag, Darmstadt 1995, ISBN 3-928865-18-8 , s.  48, 65 .
  2. ↑ a b c d A. Ehringhaus: Mikroskop to podstawa naukowa i zastosowanie . Wydanie II. Wydawnictwo B.G. Teubner, Lipsk i Berlin 1938, s. 95-109 .
  3. ↑ Sophie Perrot: Oświetlenie jest alfą i omegą!Dobór odpowiedniego oświetlenia do zastosowań w przemysłowym przetwarzaniu obrazu . W: Optyka i fotonika . taśma 3 . Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 2010, s. 51-55 ( wiley-vch.de [PDF]).
  4. ↑ Oleg Kolosov i Kazushi Yamanaka: Regulowana krawędź noża akustycznego do obrazowania akustycznego anizotropowego i ciemnego pola . W: Jpn. J. Appl. Fiz. taśma 33 , 1994, s. 329-333 , doi : 10.1143 / JJAP.33.329 .
  5. ↑ a b c d e f g h i Randy O. Wayne: Mikroskopia światła i wideo . Prasa akademicka, Elesevier, 2009, ISBN 978-0-12-374234-6 , s. 95-98 .
  6. ↑ a b c d e f g h Dieter Gerlach: Mikroskop świetlny. Wprowadzenie do funkcji, obsługi i specjalnych procedur dla lekarzy i biologów . Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976, ISBN 3-13-530301-2 , s. 119-126 .
  7. ↑ a b Horst Riesenberg: Układ optyczny mikroskopu w: Hermann Beyer, Horst Riesenberg (Hrsg.): Handbuch der Mikoskopie . 3. Wydanie. VEB Verlag Technik, Berlin 1988, ISBN 3-341-00283-9 , s. 24-107 . Strona 107
  8. ^ B Savile Bradbury Peter Evennett: techniki kontrastu w mikroskopie świetlnym . Wyd.: Królewskie Towarzystwo Mikroskopowe, Podręczniki mikroskopowe. BIOS Scientific Publishers Limited, 1996, ISBN 1-85996-085-5 , s. 32-33 .
  9. ↑ Heinz Appelt: Wprowadzenie do metod badań mikroskopowych . Wydanie IV. Wydawnictwo akademickie Geest & Portig KG, Lipsk 1959, s. 106 f .
  10. ^ Strona internetowa Nikon Microscopy U, Stereomikroskopia: oświetlenie ciemnego pola .
  11. ↑ JB Reade: Nowa metoda oświetlania obiektów mikroskopowych . W: CR Goring, Andrew Pritchard (red.): Micrographia: zawiera praktyczne eseje na temat mikroskopów refleksyjnych, słonecznych, gazowych tlenowo-wodorowych; mikrometry; okulary itp. & c . 1837, zał. 2, s. 227–231 ( ograniczony podgląd w wyszukiwarce Google Book).
  12. ^ John Thomas Queckett: Praktyczny traktat na temat korzystania z mikroskopu . Wydanie II. Wydawnictwo H. Bailliere, Londyn 1852, s. 194 ( ograniczony podgląd w wyszukiwarce Google Book).
  13. ↑ a b c d e f g h i j k Dieter Gerlach: Historia mikroskopii . Verlag Harri Deutsch, Frankfurt nad Menem 2009, ISBN 978-3-8171-1781-9 , s. 663-676 .
  14. ↑ a b Henry Siedentopf : Prehistoria kondensatorów lustrzanych . W: Journal of Scientific Microscopy . taśma 24 , 1907, s. 382-395 (on- line ).
  15. ^ FH Wenham: O metodzie oświetlania nieprzezroczystych obiektów pod najwyższymi mocami mikroskopu . W: Transakcje Towarzystwa Mikroskopowego w Londynie . taśma 4 , 1856, s. 55–60 ( ograniczony podgląd w Google Book Search).
  16. ↑ Henry Siedentopf : Kondensator paraboloidowy, nowa metoda oświetlenia ciemnego pola do wizualizacji i natychmiastowej mikrofotografii żywych bakterii itp. (zwłaszcza dla Spriochaete pallida) . W: Journal of Scientific Microscopy . taśma 24 , 1907, s. 104-108 ( online ).
  17. ↑ Hubert de Martin, Waltraud de Martin: Cztery wieki mikroskopu . Weilburg Verlag, Wiener Neustadt 1983, ISBN 3-900100-06-3 , s. 134 .
  18. ^ Mortimer Abramowitz, Michael W. Davidson: Rheinberg Oświetlenie. W: Wyrażenia molekularne - podkład optyczny. Florida State University, dostęp 17 maja 2012 r .
  19. ^ B Rainer Wegerhoff Olaf WEIDLICH Manfred Kässens: kontrastu i mikroskopii . W: Podstawy mikroskopii świetlnej i obrazowania. Specjalna edycja Imaging & Microscopy in Collaboration with Olympus . Wydanie II. 2011, s. 22-33 ( pobierz ).
  20. ^ HG Kapitza: Mikroskopia od początku . Wydanie drugie poprawione. Carl Zeiss Jena GmbH, 1997, s. 32 ( strona pobierania ).
  21. ↑ a b Dieter Gerlach: Mikroskop świetlny. Wprowadzenie do funkcji, obsługi i specjalnych procedur dla lekarzy i biologów . Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976, ISBN 3-13-530301-2 , s. 220 f .
  22. ↑ Broszura z Zeiss Stemi DR, Stemi DV4, Stemi 2000 stereomicroscopes , dostęp 8 lipca 2012
  23. ↑ Ehlert & Partner: oświetlenie LED do stereomikroskopii , dostęp 8 lipca 2012 r.
  24. ↑ a b Broszura firmy Zeiss: Źródła zimnego światła KL1500 LCD i KL 2500 LCD , dostęp 8 lipca 2012
  25. ↑ a b R. Gieseler: Stereomikroskopia . W: Horst Robenek (red.): Mikroskopia w badaniach i praktyce . GIT-Verlag, Darmstadt 1995, ISBN 3-928865-18-8 , s. 87-127 . str. 109
  26. ↑ a b P. W. Elbers, C. Ince: Mechanizmy choroby krytycznej – klasyfikacja zaburzeń przepływu mikrokrążenia we wstrząsie dystrybucyjnym. W: Opieka krytyczna. Tom 10, numer 4, 2006, ISSN  1466-609X , s. 221. doi: 10.1186 / cc4969 , PMID 16879732 , PMC 1750971 (pełny tekst dowolny), (recenzja).
  27. ↑ a b CM Treu, O. Lupi, DA Bottino, E. Boushela: Obrazowanie ciemnego pola bocznego: ewolucja wizualizacji mikrokrążenia skórnego w czasie rzeczywistym i jego potencjalne zastosowanie w dermatologii. W: Archiwum badań dermatologicznych. Tom 303, numer 2, marzec 2011, ISSN  1432-069X , s. 69 ff., Doi: 10.1007 / s00403-010-1087-7 , PMID 20972572 (przegląd).
  28. ^ Robert Andrews Millikan : Izolacja jonu, precyzyjny pomiar jego ładunku i korekta prawa Stokesa . W: Przegląd fizyczny (seria I) . taśma 32 , nie. 4 , 1911, s. 349-397 , doi : 10.1103 / PhysRevSeries I.32.349 .
  29. ↑ Wykrywanie substancji nieorganicznych: 8. Ogólne wykrywanie metali. W: Benno Romeis , Peter Böck (red.): Technologia mikroskopowa. Wydanie 17. Urban & Schwarzenberg , Monachium / Wiedeń / Baltimore 1989, ISBN 3-541-11227-1 , s. 429.
  30. ↑ H. Siedentopf, R. Zsigmondy: O wizualizacji i określaniu wielkości cząstek ultramikroskopowych, ze specjalnym zastosowaniem do złotych szkieł rubinowych . W: Roczniki Fizyki . taśma 315 , 1902, s. 1-39 , doi : 10.1002 / i s . 19023150102 .
  31. ↑ W. Gebhardt: Dla warsztatów optycznych i mechanicznych I . W: Journal of Scientific Microscopy . taśma 24 , nie. 4 , 1907, s. 396-421 ( online ).
  32. ↑ Timo Mappes, Norbert Jahr, Andrea Csáki, Nadine Vogler, Jürgen Popp i Wolfgang Fritzsche: Wynalezienie ultramikroskopu immersyjnego w 1912 r. – Początek nanotechnologii? . W: Angewandte Chemie . 124, nr 45, 2012, s. 11307-11375. doi : 10.1002 / anie.201204688 .
  33. ^ Douglas B. Murphy: Podstawy mikroskopii świetlnej i obrazowania elektronicznego . Wiley-Liss, Nowy Jork 2001, ISBN 978-0-471-25391-4 , s. 112-115 .
  34. ↑ Jan Albers: Zanieczyszczenia w mikrostrukturze . Wydanie I. Hanser Verlag, 2005, ISBN 978-3-446-40291-1 , s. 110-113 (w Książkach Google ).
  35. ↑ ETH Zurich, Praktyczne IV: Metalograficzna mikroskopia świetlna Praktyczna IV: Metalograficzna mikroskopia świetlna ( Memento z 22 stycznia 2016 r. w Internet Archive ) (PDF; 5,5 MB), dostęp 8 lipca 2012 r.
  36. ↑ Buehler: Suma naszych doświadczeń: Przewodnik po przygotowaniu materiałów i ich ocenie ( Memento z 20.01.2013 w Internet Archive ) (PDF; 5,0 MB), dostęp 8 lipca 2012
  37. ^ B Edzard Ernst : gojenia lub Humbug: 150 alternatywnych procedur medycznych z akupunktury jodze . Wydanie I. Springer, Berlin 2020, ISBN 978-3-662-61708-3 , s. 80-81 , doi : 10.1007/978-3-662-61709-0 .
  38. ↑ Samer El-Safadi i wsp.: Czy mikroskopia ciemnego pola Enderleina pozwala na diagnozę raka? Badanie prospektywne . W: Badania w komplementarnej i klasycznej medycynie naturalnej . taśma 12 , 2005, s. 148-151 , doi : 10.1159 / 000085212 .